마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

Summary

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

Abstract

마이코박테리아를 포함한 대부분의 박테리아는 세포외 소포체(EV)를 생성합니다. 박테리아 EV(bEV)에는 대사 산물, 지질, 단백질 및 핵산을 포함한 세포 구성 요소의 하위 집합이 포함되어 있기 때문에 여러 그룹에서 서브유닛 백신 후보로서의 보호 효능에 대해 bEV의 네이티브 또는 재조합 버전을 평가했습니다. 네이티브 EV와 달리 재조합 EV는 하나 이상의 관심 면역원을 포함하도록 분자 공학적으로 설계되었습니다. 지난 10년 동안 여러 그룹에서 재조합 bEV를 생성하기 위한 다양한 접근 방식을 탐구했습니다. 그러나 여기서는 마이코박테리아에서 재조합 마이코박테리아 EV(mEV)의 설계, 구성 및 농축을 보고합니다. 이를 위해 우리는 무독성 토양 마이코박테리움인 Mycobacterium smegmatis (Msm)를 모델 시스템으로 사용합니다. 먼저 Msm의 네이티브 EV의 생성과 강화에 대해 설명합니다. 그런 다음 적색 형광 리포터 단백질인 mCherry 또는 Mycobacterium tuberculosis의 저명한 면역원인 EsxA(Esat-6)를 포함하는 재조합 mEV의 설계 및 구성에 대해 설명합니다. mCherry와 EsxA N-말단을 작은 Msm 단백질 Cfp-29의 C-말단과 별도로 융합하여 이를 달성합니다. Cfp-29는 MsmEV에 풍부하게 존재하는 몇 안 되는 단백질 중 하나입니다. Msm에서 재조합 mEV를 생성하고 농축하는 프로토콜은 Msm의 네이티브 EV의 생성 및 농축과 동일하게 유지됩니다.

Introduction

전염병에 대한 광범위한 백신의 개발 및 투여에도 불구하고 오늘날까지도 모든 인간 사망의 ~30%는 여전히 전염병으로 인해 발생합니다¹. 결핵(TB) 백신인 Bacillus Calmette Guerin(BCG)이 등장하기 전에는 결핵이 사망 원인 1위였습니다(~10,000명에서 15,000명/100,000명)². BCG의 투여와 1차 및 2차 항결핵제에 대한 쉬운 접근으로 2022년까지 결핵 관련 사망은 2022년까지 ~100만명/년으로 급격히 감소했다(즉, ~15-20/100,000 인구¹). 그러나 전 세계 결핵 풍토병 인구에서 결핵 관련 사망자는 인구 100,000명당 ~100-550명에 머물고^{있다 1}. 전문가들은 이러한 왜곡된 수치를 초래하는 몇 가지 이유를 인정하지만, BCG에 의한 보호가 생후 첫 10년 동안도 지속되지 않는 것이 3,4,5,6,7의 주된 원인인 것으로 보인다. 결과적으로, UN의 ‘지속가능발전목표’와 WHO의 ‘결핵 퇴치 전략’이 새로워짐에 따라, 결핵으로부터 평생 보호해 줄 수 있는 BCG보다 훨씬 우수한 백신을 개발하기 위한 전 세계적인 공동의 노력이 이루어지고 있습니다.

이 목표를 달성하기 위해 여러 그룹에서 현재 변형/재조합 BCG 균주, BCG 이외의 비병원성 및 약독화 마이코박테리아 종, 서브유닛 후보 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18을 평가하고 있습니다 . 일반적으로 서브유닛 백신은 병원체의 정제된(~1-6) 전장 또는 절단된 면역원성 단백질이 거의 없는 리포좀입니다. 그러나, 비-네이티브(non-native) 형태로의 가짜 접힘 및/또는 로드된 단백질 사이의 무작위적인 비기능적 상호작용으로 인해, 서브유닛은 종종 네이티브 및 게르만 에피토프(germane epitope)가 부족하여 면역계를 충분히 프라이밍하지 못한다^14,19,20.

결과적으로, 박테리아의 세포외 소포체(EV)는 유망한 대안으로 속도를 내고 있습니다 21,22,23,24,25,26. 전형적으로, 박테리아 EV(bEV)는 핵산, 지질, 수백 개의 대사 산물 및 단백질의 일부를 포함하는 세포 구성 요소의 하위 집합을 포함합니다^27,28. 몇 가지 정제된 단백질이 인위적으로 로드되는 리포솜과 달리, bEV는 특히 보조제 및 톨 유사 수용체(TLR) 작용제의 부스트/보조 없이 면역 체계를 프라이밍하는 더 나은 성향을 가진 수백 개의 자연적으로 로드되고 자연스럽게 접힌 단백질을 포함합니다^27,28,29. 이러한 연구 분야에서 당사와 다른 연구자들은 BCG³⁰에 대한 잠재적인 서브유닛 부스터로서 마이코박테리아 EV의 유용성을 탐구했습니다. bEV가 균일한 항원 부하가 부족하다는 우려에도 불구하고, 약독화된 Neisseria meningitidis의 EV는 혈청군 B 수막구균으로부터 인간을 성공적으로 보호했습니다^31,32.

적어도 이론적으로는 BCG를 잘 부스트할 수 있는 최고의 EV는 병원성 박테리아가 농축된 EV입니다. 그러나 병원성 마이코박테리움에 의해 생성된 EV를 농축하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 위험합니다. 또한 병원체에서 생성된 EV는 보호 기능보다 독성이 더 강할 수 있습니다. 잠재적인 위험을 감안하여, 여기에서는 독성이 강한 마이코박테리움인 축삭 배양 Msm에 의해 생성된 EV의 농축에 대해 잘 테스트된 프로토콜을 보고합니다.

그러나, 여러 병원체 단백질 ortholog를 암호화하고 있음에도 불구하고, 독성 마이코박테리아는 면역 체계를 보호하기 위해 충분히 준비시키는 데 필요한 몇 가지 백신 항원/병원성 단백질 에피토프가 부족하다³³. 따라서 분자 공학을 통해 Msm의 재조합 EV를 구성하고 농축하여 Msm에서 발현되고 번역된 관심 병원성 단백질의 상당 부분이 EV에 도달해야 하는 연구도 수행했습니다. 우리는 Msm EV의 상위 10개 풍부한 단백질 중 하나 이상이 관심 단백질에 융합될 때 이러한 전좌에 도움이 될 것이라는 가설을 세웠습니다.

실험실에서 마이코박테리아 EV(mEV)의 농축을 표준화하기 시작했을 때, 2011년 Prados-Rosales et al.은 시험관 내 mEV의 시각화 및 농축을 처음으로 보고했습니다 ³⁰. 이후 2014년에 같은 그룹이 2011년 방법³⁴의 수정된 버전을 발표했습니다. 2015년에 Lee et al.은 또한 mycobacteria³⁵의 액센 배양에서 mEV 농축을 위한 독립적으로 표준화된 방법을 보고했습니다. 두 프로토콜 34,35를 결합하고 철저한 표준화 후 몇 가지 수정 사항을 통합하여^, 마이코박테리아³⁶의 액센 배양으로부터 mEV를 일상적으로 농축하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.

여기에서, 우리는 일반적으로 마이코박테리아 EV의 농축을 위해 발표된 프로토콜³⁶의 확장인 Msm-특이적 EV의 농축에 대해 특히 자세히 설명합니다. 또한 mCherry 단백질(적색 형광 리포터)과 Mycobacterium tuberculosis의 우세한 면역원이자 잠재적인 하위 단위 백신물질인 EsxA(Esat-6)37,38,39를 포함하는 재조합 mEV(R-mEV)를 구성하는 방법에 대해서도 자세히 설명합니다. R-mEV를 강화하기 위한 프로토콜은 Msm의 기본 EV를 강화하기 위해 설명한 프로토콜과 동일합니다.

Protocol

1. Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli 및 그 유도체의 성장 조건 미디어미들브룩 7H9 액체 육수유리 비커에 필요한 양의 이중 증류수(ddw)를 전자레인지에서 ~45-50oC로 사전 데워 20% Tween-80 원액을 준비하고, 적절한 측정 실린더를 사용하여 필요한 부피의 Tween-80을 추가하고, 작은 자석 교반기에서 계속 저어 20% Tween-80을 균일?…

Representative Results

M. smegmatis(Msm)를 모델 마이코박테리움으로 사용하여 네이티브 및 재조합 mEV(R-mEV)의 농축을 입증합니다. 이 개략적으로 요약된 mEV 농축 프로토콜(그림 1)은 Msm의 R-mEV 및 Mtb의 네이티브 EV의 농축에도 작동합니다(1.2의 프로토콜 노트에서와 같이 약간의 수정 포함). 농축된 mEV를 시각화하려면 투과 전자 현미경(36)으로 음성으로 염색해야 합니다(<strong clas…

Discussion

BCG보다 우수하고 BCG를 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신을 개발하는 것은 여전히 만만치 않은 과제로 남아 있기 때문에, 대안으로 여러 그룹에서 BCG의 효능을 높이고 보호 기간을 연장할 수 있는 다양한 소단위 결핵 백신의 발견을 추구하고 있습니다^48,49. 박테리아 EV(bEV)가 잠재적인 소단위체(subunit) 및 천연 보조제(natural adjuvants^)50,51)?…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155