Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

Summary

Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.

Abstract

Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell’impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell’ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell’intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un’aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell’efficienza di solubilizzazione dell’agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un’indagine sull’attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l’antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.

Introduction

Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive¹. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un’apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l’apoA-I. Nel metabolismo delle lipoproteine umane, le HDL nascenti circolanti accumulano lipidi dalle cellule periferiche e maturano in HDL sferiche in un processo che dipende da mediatori proteici chiave, tra cui il trasportatore di cassette leganti ATP A1 e lecitina: colesterolo aciltransfere². Questo processo rappresenta una componente critica della via di trasporto inversa del colesterolo che è considerata protettiva contro le malattie cardiache. Armati di questa conoscenza e della capacità di ricostituire HDL discoidali, i ricercatori hanno impiegato queste particelle come intervento terapeutico per trattare l’aterosclerosi³. In sostanza, l’infusione di HDL ricostituito (rHDL) nei pazienti promuove l’efflusso di colesterolo dai depositi di placca e lo restituisce al fegato per la conversione in acidi biliari e l’escrezione dal corpo. Diverse aziende biotecnologiche/farmaceutiche stanno perseguendo questa strategia di trattamento⁴.

Allo stesso tempo, la capacità di generare queste particelle in laboratorio ha scatenato una raffica di attività di ricerca che hanno portato a nuove applicazioni e nuove tecnologie. Un’applicazione importante riguarda l’uso di particelle rHDL come membrana in miniatura per ospitare proteine transmembrana in un ambiente nativo⁵. Ad oggi, centinaia di proteine sono state incorporate con successo nella rHDL discoidale e la ricerca ha dimostrato che queste proteine mantengono sia la conformazione nativa che l’attività biologica come recettori, enzimi, trasportatori, ecc. Queste particelle, denominate “nanodischi”, hanno anche dimostrato di essere suscettibili di caratterizzazione strutturale, spesso ad alta risoluzione⁶. Questo approccio allo studio delle proteine transmembrana è riconosciuto come superiore agli studi con micelle detergenti o liposomi e, di conseguenza, sta rapidamente avanzando. È importante riconoscere che sono stati descritti due metodi distinti che sono in grado di formare un rHDL. Il metodo “dialisi colata”¹³ è popolare per applicazioni relative all’incorporazione di proteine transmembrana nel^{bistrato 5} rHDL. Essenzialmente, questo metodo di formulazione prevede la miscelazione di un fosfolipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e la proteina transmembrana di interesse in un tampone contenente il detergente colato di sodio (o desossicolato di sodio; peso molecolare della micella [MW] di 4.200 Da). Il detergente solubilizza efficacemente i diversi componenti della reazione, consentendo di dializzare il campione contro tampone privo di detergente. Durante la fase di dialisi, quando il detergente viene rimosso dal campione, si forma spontaneamente un rHDL. Quando questo approccio viene utilizzato per intrappolare una proteina transmembrana di interesse, le particelle prodotto sono state definite nanodischi⁵. I tentativi di utilizzare questo metodo per incorporare agenti bioattivi idrofobici a piccole molecole (MW <1.000 Da), tuttavia, sono stati in gran parte infruttuosi. A differenza delle proteine transmembrana, gli agenti bioattivi a piccole molecole sono in grado di fuoriuscire dalla sacca di dialisi insieme al detergente, diminuendo notevolmente la loro efficienza di incorporazione nelle rHDL. Questo problema è stato risolto omettendo i detergenti dalla miscela di formulazione¹⁴. Invece, i componenti vengono aggiunti a un tampone acquoso in sequenza, iniziando con il lipide che forma il doppio strato, formando un agente bioattivo stabile contenente rHDL, indicato come nanodisk. Altri hanno utilizzato rHDL per l’incorporazione e il trasporto di agenti di imaging in vivo ⁷. Più recentemente, rHDL specializzato composto da un’impalcatura di apolipoproteina e il glicerofosfolipide anionico, cardiolipina, sono stati impiegati in studi di legame del ligando. Queste particelle forniscono una piattaforma per studi sull’interazione della cardiolipina con vari ligandi solubili in acqua, tra cui calcio, citocromo c e l’agente antitumorale doxorubicina⁸.

Il focus del presente studio è sulla formulazione di rHDL che possiedono un agente bioattivo idrofobico stabilmente incorporato (cioè nanodisk). La capacità di questi agenti di integrarsi nell’ambiente lipidico delle particelle rHDL discoidali conferisce loro efficacemente la solubilità acquosa. In quanto tali, i nanodischi hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche in vivo . Quando si formulano i nanodisk, sono necessarie specifiche condizioni di incubazione / reazione per incorporare con successo agenti bioattivi idrofobici discreti nella particella del prodotto e l’obiettivo di questo rapporto è fornire informazioni pratiche dettagliate che possono essere utilizzate come modello fondamentale per la creazione di nuove particelle di nanodisk per applicazioni specifiche. Pertanto, nel contesto di questo manoscritto i termini nanodisco e nanodisco non sono intercambiabili. Mentre nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per contenere una proteina transmembrana incorporata nel suo doppio strato lipidico⁵, il termine nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per incorporare agenti bioattivi idrofobici a basso peso molecolare (< 1.000 Da), come l'amfotericina B¹⁴.

Sono disponibili vari metodi per l’acquisizione di proteine di scaffold adatte. È possibile acquistare proteine di scaffold da produttori [ad esempio apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], tuttavia, il costo può essere un fattore limitante. Un approccio preferito è quello di esprimere le proteine dello scaffold ricombinante in Escherichia coli. I protocolli sono pubblicati per l’apoA-I⁹, l’apoE4¹⁰ umano e la proteina emolinfatica degli insetti apolipophorin-III¹¹. Ai fini degli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato il dominio ricombinante umano apoE4 N-terminale (NT) (amminoacidi 1-183). La sequenza nucleotidica che codifica per l’apoE4-NT umano è stata sintetizzata e inserita in un vettore di espressione pET-22b (+) direttamente adiacente alla sequenza leader pelB codificata da vettori. Questo costrutto porta all’espressione di una proteina di fusione pelB leader sequence-apoE4-NT. Dopo la sintesi proteica, la sequenza leader pelB batterica dirige la proteina appena sintetizzata nello spazio periplasmatico dove la peptidasi leader fende la sequenza pelB. La proteina apoE4-NT risultante, senza tag di sequenza o code, successivamente sfugge ai batteri e si accumula nel terreno di coltura^11,12, semplificando l’elaborazione a valle.

Protocol

1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NTScongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti. Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio. Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere <s…

Representative Results

Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattiviNella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l’aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l’agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d’onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q10<…

Discussion

La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell’agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un’ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard …

Materials

Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay