Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe
Summary
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.
Abstract
Fibroblasten, der wichtigste Zelltyp im Keloidgewebe, spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung und Entwicklung von Keloiden. Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen der biologischen Funktion und der molekularen Mechanismen von Keloiden sowie für neue therapeutische Strategien zu ihrer Behandlung. Die traditionelle Methode zur Gewinnung primärer Fibroblasten hat Einschränkungen, wie z. B. einen schlechten Zellzustand, eine Vermischung mit anderen Zelltypen und eine Anfälligkeit für Kontamination. In diesem Artikel wird ein optimiertes und leicht reproduzierbares Protokoll beschrieben, das das Auftreten möglicher Probleme bei der Gewinnung von Fibroblasten reduzieren könnte. In diesem Protokoll können Fibroblasten 5 Tage nach der Isolierung beobachtet werden und erreichen nach 10 Tagen Kultur eine Konfluenz von fast 80 %. Anschließend werden die Fibroblasten mit PDGFRα- und Vimentin-Antikörpern für Immunfluoreszenz-Assays und CD90-Antikörpern für die Durchflusszytometrie verifiziert und verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fibroblasten aus Keloidgewebe durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden können, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann.
Introduction
Keloid, eine fibroproliferative Erkrankung, manifestiert sich durch das kontinuierliche Wachstum von Plaques, die oft ohne Selbstbeschränkung in die umgebende normale Haut eindringen und bei den Patienten verschiedene Grade von Juckreiz, Schmerzen sowie kosmetischen und psychischen Belastungen verursachen1. Fibroblasten, die primären Zellen, die an Keloiden beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Krankheit durch übermäßige Proliferation, redundante extrazelluläre Matrixproduktion und desorganisierte Kollagene 2,3. Die zugrundeliegende Pathogenese ist jedoch noch unklar, und es fehlt noch an einer wirksamen therapeutischen Methode für Keloide; Daher besteht dringender Bedarf an weiterer Forschung 4,5.
Da es kein ideales Tiermodell für die Keloidforschung in vivo gibt 6,7, kann der Aufbau eines In-vitro-Modells durch die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben die Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit für die Keloidforschung bieten 2,6. Primärzellen sind solche, die direkt aus lebendem Gewebe stammen, und es ist allgemein anerkannt, dass diese Zellen dem physiologischen Zustand und dem genetischen Hintergrund mehrerer Individuen im Vergleich zu Zelllinien ähnlicher sein können 8,9. Die Kultivierung von Primärzellen bietet ein leistungsfähiges Mittel, um das Wachstum und den Stoffwechsel von Zellen sowie andere Zellphänotypen zu untersuchen.
Derzeit gibt es zwei Methoden zur Gewinnung von primären Fibroblasten: den Enzymverdau und die Explantatkultur. Es wurden jedoch mehrere Hindernisse für die Gewinnung von primären Fibroblasten identifiziert, wie z. B. das Risiko einer Kontamination durch verschiedene Bakterien oder Pilze, die Vermischung mit anderen Zelltypen, die nicht leicht zu entfernen sind, die lange Dauer des Kulturzyklus, die anschließenden Veränderungen der Zelleigenschaften im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen usw. 9. Daher ist die Entwicklung eines praktikablen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung primärer Fibroblasten die Grundlage für weitere Studien und Anwendungen. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Extraktion von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, das effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe ist eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung. Bisher gab es zwei Methoden zur Gewinnung primärer Fibroblasten: Enzymverdau und Explantatkultur11,12,13,14. Beide traditionellen Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. die Anfälligkeit für Kontamination, die Vermischung mit anderen Zelltypen, eine lange Kulturzeit und…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81903189 und 82073418) und der Science and Technology Foundation of Guangzhou (Fördernummer 202102020025) unterstützt.
Materials
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
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