मानव तंत्रिका संरचनाओं के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए माइक्रोगेल-एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स कम्पोजिट सपोर्ट
Summary
यह काम स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स कंपोजिट के अंदर तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के फ्रीफॉर्म एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल उच्च निष्ठा के साथ परस्पर जुड़े मानव तंत्रिका ऊतक संरचनाओं के प्रोग्राम करने योग्य पैटर्निंग को सक्षम बनाता है।
Abstract
एक दानेदार समर्थन माध्यम के अंदर कोशिकाओं की एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग पिछले दशक में नरम ऊतक संरचनाओं के फ्रीफॉर्म बायोफैब्रिकेशन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरी है। हालांकि, दानेदार जेल फॉर्मूलेशन को सीमित संख्या में बायोमैटेरियल्स तक सीमित कर दिया गया है जो बड़ी मात्रा में हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल्स की लागत प्रभावी पीढ़ी की अनुमति देते हैं। इसलिए, दानेदार जेल समर्थन मीडिया में आम तौर पर देशी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में पाए जाने वाले सेल-चिपकने वाले और सेल-शिक्षाप्रद कार्यों की कमी होती है।
इसे संबोधित करने के लिए, स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स (शेप) कंपोजिट की पीढ़ी के लिए एक पद्धति विकसित की गई है। शेप कंपोजिट में एक दानेदार चरण (माइक्रोगेल) और एक निरंतर चरण (चिपचिपा ईसीएम समाधान) होता है, जो एक साथ, प्रोग्राम करने योग्य उच्च-निष्ठा मुद्रण और एक समायोज्य जैव-कार्यात्मक बाह्य वातावरण दोनों की अनुमति देता है। यह काम बताता है कि मानव तंत्रिका संरचनाओं के सटीक बायोफैब्रिकेशन के लिए विकसित पद्धति का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
सबसे पहले, एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स, जो शेप कंपोजिट में दानेदार घटक के रूप में काम करते हैं, को कोलेजन-आधारित निरंतर घटक के साथ निर्मित और संयुक्त किया जाता है। फिर, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को समर्थन सामग्री के अंदर मुद्रित किया जाता है, इसके बाद समर्थन की एनीलिंग होती है। मुद्रित संरचनाओं को न्यूरॉन्स में मुद्रित कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देने के लिए हफ्तों तक बनाए रखा जा सकता है। इसके साथ ही, कोलेजन निरंतर चरण अक्षीय वृद्धि और क्षेत्रों के अंतर्संबंध की अनुमति देता है। अंत में, यह काम 3 डी-मुद्रित मानव तंत्रिका संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए लाइव-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री करने के तरीके के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
Introduction
सेल से लदी हाइड्रोगेल संरचनाओं की सटीक और प्रोग्राम करने योग्य 3 डी प्रिंटिंग जो विट्रो में नरम ऊतकों की नकल करती है, एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, नरम हाइड्रोगेल के प्रत्यक्ष एक्सट्रूज़न पर आधारित प्रयास स्वाभाविक रूप से समस्याग्रस्त हैं, क्योंकि विवो माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक खराब यांत्रिक गुणों से संरचनात्मक अखंडता की कमी, पूर्वनिर्धारित विशेषताओं की विकृति, या गढ़ी गई संरचनाओं का पूर्ण पतन होता है। इस मुद्दे के लिए एक पारंपरिक समाधान एक कठोर जैव-संगत सामग्री से एक सहायक मचान मुद्रित करना है जो अंतिम निर्माण को अपना आकार बनाए रखने की अनुमति देता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण डिजाइन की संभावनाओं को बहुत सीमित करता है और आसन्न स्याही के सावधानीपूर्वक रियोलॉजिकल फाइन-ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है।
पारंपरिक परत-दर-परत एक्सट्रूज़न-आधारित 3 डी प्रिंटिंग की सीमाओं को दूर करने के लिए, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग हाल के वर्षों में नरम सामग्री और ऊतक निर्माण 1,2,3,4,5,6 के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में उभरी है। एक सतह के शीर्ष पर परिवेशी हवा में स्याही को बाहर निकालने के बजाय, स्याही को सीधे एक समर्थन स्नान के अंदर एक सिरिंज सुई के माध्यम से जमा किया जाता है जो आराम से ठोस जैसा होता है, लेकिन नरम सेल से लदी सामग्री के सटीक जमाव की अनुमति देने के लिए चलती सुई की नोक के चारों ओर विपरीत रूप से द्रवित होता है। जमा की गई सामग्री को जगह में रखा जाता है क्योंकि सुई के मद्देनजर समर्थन फिर से जम जाता है। जैसे, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग विस्तारित डिजाइन संभावनाओं 7,8 के साथ नरम बायोमैटेरियल्स से जटिल संरचनाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्रीफॉर्म निर्माण की अनुमति देता है।
एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए समर्थन स्नान सामग्री के रूप में दानेदार जैल का बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है, क्योंकि उन्हें कम उपज तनाव 9,10,11 पर चिकनी, स्थानीयकृत और प्रतिवर्ती ठोस-से-तरल संक्रमण प्रदर्शित करने के लिए तैयार किया जा सकता है। जबकि वे उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रिंटिंग के लिए उत्कृष्ट रियोलॉजिकल गुण दिखाते हैं, दानेदार जैल को मुट्ठी भर बायोमैटेरियल्स12 तक सीमित कर दिया गया है। दानेदार जेल फॉर्मूलेशन में विविधता की कमी, जो विशेष रूप से स्पष्ट है यदि कोई थोक हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन के लिए उपलब्ध बायोमैटेरियल्स की विस्तृत श्रृंखला पर विचार करता है, तो सरल रसायनज्ञों का उपयोग करके बड़ी संख्या में माइक्रोगेल की लागत प्रभावी पीढ़ी की आवश्यकता के कारण होता है। दानेदार जेल समर्थन के सीमित बायोमटेरियल परिदृश्य के कारण, प्रिंटिंग समर्थन द्वारा प्रदान किए गए बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट की ट्यूनिंग क्षेत्र में एक चुनौती प्रस्तुत करती है।
हाल ही में, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग समर्थन की पीढ़ी के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसे स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स (शेप) कंपोजिट13 कहा जाता है। यह दृष्टिकोण थोक हाइड्रोगेल योगों की जैव-कार्यात्मक बहुमुखी प्रतिभा के साथ दानेदार जैल के विशिष्ट रियोलॉजिकल गुणों को जोड़ता है। प्रस्तुत शेप कम्पोजिट समर्थन में पैक ्ड एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स (दानेदार चरण, ~ 70% वॉल्यूम अंश) होते हैं, जिसमें चिपचिपा कोलेजन-आधारित ईसीएम प्रीगेल समाधान (निरंतर चरण, ~ 30% वॉल्यूम अंश) से भरा एक बढ़ा हुआ अंतरालीय स्थान होता है। यह आगे दिखाया गया है कि शेप समर्थन मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एचएनएससी) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन जमाव की सुविधा प्रदान करता है, जो समर्थन स्नान के एनीलिंग के बाद, न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है और कार्यात्मक परिपक्वता तक पहुंचने के लिए हफ्तों तक बनाए रखा जा सकता है। शेप सपोर्ट बाथ के अंदर एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग एक बहुमुखी मंच प्रदान करते हुए तंत्रिका ऊतक बायोफैब्रिकेशन के लिए पारंपरिक तकनीकों से संबंधित कुछ प्रमुख सीमाओं को दूर करती है।
यह काम शेप समर्थन के अंदर एचएनएससी के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग और कार्यात्मक न्यूरॉन्स में उनके बाद के भेदभाव के लिए चरणों का विवरण देता है (चित्रा 1)। सबसे पहले, आंतरिक गेलेशन के दौरान कतरनी के माध्यम से एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स उत्पन्न होते हैं। यह दृष्टिकोण विशेष उपकरणों और साइटोटोक्सिक अभिकर्मकों की आवश्यकता के बिना माइक्रोपार्टिकल्स की बड़ी मात्रा की आसान पीढ़ी की अनुमति देता है। इसके अलावा, एल्गिनेट सेल प्रकारों की एक विविध श्रृंखला के लिए बायोकंपैटिबल हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स के गठन के लिए एक व्यापक रूप से उपलब्ध और किफायती सामग्री स्रोत है। उत्पन्न एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स को शेप समग्र समर्थन सामग्री बनाने के लिए कोलेजन समाधान के साथ जोड़ा जाता है। फिर, एचएनएससी को काटा जाता है और 3 डी प्रिंटिंग के लिए सेलुलर बायोइंक के रूप में एक सिरिंज में लोड किया जाता है। शेप कम्पोजिट के अंदर एचएनएससी के एक्सट्रूज़न-आधारित एम्बेडेड प्रिंटिंग के लिए एक 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग किया जाता है। 3 डी-मुद्रित कोशिकाओं को स्थानिक रूप से परिभाषित और कार्यात्मक मानव तंत्रिका संरचनाओं को जन्म देने के लिए न्यूरॉन्स में विभेदित किया जाता है। अंत में, प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे उत्पन्न ऊतक संरचनाओं को लाइव-सेल इमेजिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है। साथ ही, अनुकूलन और समस्या निवारण के लिए युक्तियाँ प्रदान की जाती हैं। विशेष रूप से, दानेदार और निरंतर चरणों के दोनों घटकों को अन्य हाइड्रोगेल योगों के साथ आदान-प्रदान किया जा सकता है ताकि विभिन्न बायोफंक्शनल मोइटीज़, मैकेनिकल गुणों और क्रॉसलिंकिंग तंत्र को समायोजित किया जा सके, जैसा कि तंत्रिका अनुप्रयोगों से परे अन्य सेल और ऊतक प्रकारों द्वारा आवश्यक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
शेप समग्र सामग्री दृष्टिकोण सेलुलर स्याही के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए एनालेबल और बायोफंक्शनल सपोर्ट बाथ के निर्माण के लिए एक बहुमुखी मार्ग प्रदान करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल तंत्रिका संरचनाओं क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान को मुख्य रूप से ब्रेनमैटट्रेन यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (संख्या एच 2020-एमएससीए-आईटीएन-2015) द्वारा मैरी स्कोलोडोवस्का- क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क और अनुदान समझौते संख्या 676408 के तहत वित्त पोषित किया गया था। सीआर और जेयूएल लुंडबेक फाउंडेशन (आर 250-2017-1425) और स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (8048-00050) को उनके समर्थन के लिए कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार करना चाहते हैं। हम ओपनमाइंड के होराइजन-ईआईसी-2021-पाथफाइंडरओपन-01 प्रोजेक्ट के लिए कृतज्ञतापूर्वक वित्त पोषण 101047177 स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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