תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים
Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול להדפסה תלת-ממדית משובצת בצורה חופשית של תאי גזע עצביים בתוך חומרים מרוכבים של חלקיקים חוץ-תאיים הניתנים לריפוי עצמי. הפרוטוקול מאפשר דפוסים ניתנים לתכנות של מבנים מחוברים של רקמות עצביות אנושיות עם נאמנות גבוהה.
Abstract
ההדפסה התלת-ממדית המשובצת של תאים בתוך מדיום תמיכה גרעיני התפתחה בעשור האחרון כגישה רבת עוצמה לייצור ביולוגי חופשי של מבנים של רקמות רכות. עם זאת, פורמולציות ג’ל גרגירי הוגבלו למספר מוגבל של ביו-חומרים המאפשרים ייצור חסכוני של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקי הידרוג’ל. לכן, אמצעי תמיכה בג’ל גרגירי חסרים בדרך כלל את הפונקציות של הדבקת תאים והנחיית תאים הנמצאות במטריצה החוץ תאית הטבעית (ECM).
כדי להתמודד עם זה, פותחה מתודולוגיה ליצירת חומרים מרוכבים של מטריצה חוץ-תאית (SHAPE) הניתנת לריפוי עצמי. חומרים מרוכבים מסוג SHAPE מורכבים משלב גרגירי (מיקרו-ג’לים) ופאזה רציפה (תמיסת ECM צמיגה) אשר יחדיו מאפשרים הן הדפסה באיכות גבוהה הניתנת לתכנות והן סביבה חוץ-תאית ביו-פונקציונלית מתכווננת. עבודה זו מתארת כיצד ניתן להשתמש במתודולוגיה שפותחה לייצור ביולוגי מדויק של מבנים עצביים אנושיים.
ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט, המשמשים כמרכיב גרעיני בתרכובות SHAPE, מיוצרים ומשולבים עם רכיב רציף מבוסס קולגן. לאחר מכן, תאי גזע עצביים אנושיים מודפסים בתוך חומר התמיכה, ולאחר מכן חישול התמיכה. המבנים המודפסים יכולים להישמר במשך שבועות כדי לאפשר התמיינות של התאים המודפסים לנוירונים. במקביל, הפאזה הרציפה של הקולגן מאפשרת צמיחה אקסונלית וחיבור בין אזורים. לבסוף, עבודה זו מספקת מידע על אופן ביצוע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים ואימונוציטוכימיה כדי לאפיין את המבנים העצביים האנושיים המודפסים בתלת-ממד.
Introduction
ההדפסה התלת-ממדית המדויקת והניתנת לתכנות של מבני הידרוג’ל עמוסי תאים המחקים רקמות רכות במבחנה מהווה אתגר גדול. לדוגמה, ניסיונות המבוססים על אקסטרוזיה ישירה של הידרוג’לים רכים הם בעייתיים מטבעם, שכן התכונות המכניות הירודות הנדרשות כדי לשחזר את המיקרו-סביבה in vivo מובילות לחוסר שלמות מבנית, עיוותים של התכונות שהוגדרו מראש, או קריסה מוחלטת של המבנים המיוצרים. דרך מקובלת לעקיפת בעיה זו היא הדפסת פיגום תומך מחומר קשיח יותר בעל תאימות ביולוגית המאפשר למבנה הסופי לשמור על צורתו. עם זאת, גישה זו מגבילה מאוד את אפשרויות העיצוב ודורשת כוונון ראולוגי זהיר של הדיו הסמוך.
כדי להתגבר על מגבלות ההדפסה התלת-ממדית המסורתית המבוססת על שחול שכבה אחר שכבה, הדפסה תלת-ממדית משובצת התפתחה בשנים האחרונות כחלופה רבת עוצמה לייצור חומרים רכים ורקמות 1,2,3,4,5,6. במקום להוציא את הדיו באוויר הסביבה על גבי משטח, הדיו מושקע ישירות דרך מחט מזרק בתוך אמבט תמיכה שהוא מוצק במנוחה אך נוזל באופן הפיך סביב קצה המחט הנעה כדי לאפשר שיקוע מדויק של חומר רך עמוס תאים. החומר המושקע נשמר במקומו כאשר התמיכה מתמצקת מחדש בעקבות המחט. ככזו, הדפסה תלת-ממדית משובצת מאפשרת ייצור חופשי ברזולוציה גבוהה של מבנים מורכבים מביו-חומרים רכים עם אפשרויות עיצוב מורחבות 7,8.
ג’לים גרגיריים נחקרו בהרחבה כחומרי אמבט תומכים להדפסה תלת-ממדית משובצת, מכיוון שניתן ליצור אותם כך שיציגו מעברים חלקים, מקומיים והפיכים ממוצק לנוזל בלחצי תפוקה נמוכים 9,10,11. בעוד שהם מראים תכונות ראולוגיות מצוינות להדפסה ברזולוציה גבוהה, ג’לים גרעיניים הוגבלו לקומץ ביו-חומרים12. חוסר הגיוון בפורמולציות ג’ל גרגיריות, אשר בולט במיוחד אם לוקחים בחשבון את המגוון הרחב של ביו-חומרים הזמינים עבור פורמולציות הידרוג’ל בתפזורת, נגרם על ידי הצורך בייצור חסכוני של מספר רב של מיקרוג’לים באמצעות כימיה פשוטה. בשל הנוף הביו-חומרי המוגבל של תמיכות ג’ל גרגיריות, הכוונון של המיקרו-סביבה החוץ תאית המסופקת על ידי תמיכת ההדפסה מהווה אתגר בשטח.
לאחרונה פותחה גישה מודולרית ליצירת תמיכות הדפסה תלת-ממדיות משובצות, המכונות קומפוזיציות מרוכבות של חלקיקים חוץ-תאיים (SHAPE)13 הניתנות לריפוי עצמי. גישה זו משלבת את התכונות הריאולוגיות המובהקות של ג’לים גרגיריים עם הרבגוניות הביו-פונקציונלית של פורמולציות הידרוג’ל בתפזורת. התמיכה המרוכבת המוצגת ב- SHAPE מורכבת ממיקרו-חלקיקי אלגינט ארוזים (פאזה גרגירית, ~ 70% חלק נפח) עם חלל אינטרסטיציאלי מוגבר המלא בתמיסת פרגל ECM צמיגה מבוססת קולגן (פאזה רציפה, ~ 30% חלק נפח). עוד הוכח כי תמיכת SHAPE מאפשרת שיקוע ברזולוציה גבוהה של תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs), אשר לאחר חישול אמבט התמיכה, ניתן להתמיין לנוירונים ולשמור עליהם במשך שבועות כדי להגיע להבשלה תפקודית. הדפסה תלת-ממדית מוטבעת בתוך אמבט התמיכה של SHAPE מתגברת על כמה מהמגבלות העיקריות הקשורות לטכניקות קונבנציונליות לייצור ביולוגי של רקמות עצביות תוך מתן פלטפורמה רב-תכליתית.
עבודה זו מפרטת את השלבים להדפסה תלת-ממדית מוטמעת של תאי עצב עצביים בתוך תמיכת SHAPE ואת ההתמיינות שלהם לאחר מכן לתאי עצב פונקציונליים (איור 1). ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט נוצרים באמצעות גזירה במהלך ג’לציה פנימית. גישה זו מאפשרת יצירה קלה של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקים ללא צורך בציוד מיוחד וריאגנטים ציטוטוקסיים. יתר על כן, אלגינט הוא מקור חומר זמין וחסכוני ליצירת מצעי הידרוג’ל תואמים ביולוגית למגוון רחב של סוגי תאים. חלקיקי האלגינט הנוצרים משולבים עם תמיסת קולגן ליצירת חומר התמיכה המרוכב SHAPE. לאחר מכן, ה-hNSCs נקצרים ומועלים לתוך מזרק כביו-דיו תאי להדפסה תלת-ממדית. מדפסת ביולוגית תלת-ממדית משמשת להדפסה משובצת מבוססת שחול של hNSCs בתוך הקומפוזיט SHAPE. התאים המודפסים בתלת-ממד מתמיינים לתאי עצב כדי ליצור מבנים עצביים אנושיים מוגדרים מרחבית ומתפקדים. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לאפיין את מבני הרקמה שנוצרו באמצעות דימות תאים חיים ואימונוציטוכימיה. בנוסף, ניתנים טיפים לאופטימיזציה ולפתרון בעיות. יש לציין כי ניתן להחליף הן את המרכיבים של השלב הגרעיני והן את השלב הרציף עם פורמולציות הידרוג’ל אחרות כדי להתאים למויאטים ביו-פונקציונליים שונים, תכונות מכניות ומנגנוני הצלבה, כפי שנדרש על ידי סוגי תאים ורקמות אחרים מעבר ליישומים עצביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישת החומר המרוכב SHAPE מספקת מסלול רב-תכליתי ליצירת אמבטיות תמיכה חיישות וביו-פונקציונאליות להדפסה תלת-ממדית מוטבעת של דיו סלולרי. בעוד פרוטוקול זה מספק דוגמה להדפסה תלת-ממדית של מבנים עצביים, ארגז הכלים של SHAPE יכול בקלות להיות מותאם לייצור ביולוגי עם מקורות תאים אחרים לצורך הנדסה מדויקת ש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר מומן בעיקר על ידי תוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי BrainMatTrain (מס’ H2020-MSCA-ITN-2015) במסגרת Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network and Grant Agreement No. 676408. C.R. ו-J.U.L. רוצים להודות לקרן לונדבק (R250-2017-1425) ולקרן המחקר העצמאית דנמרק (8048-00050) על תמיכתם. אנו מודים על המימון לפרויקט HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
