Support composite à matrice microgel-extracellulaire pour l’impression 3D intégrée de constructions neuronales humaines
Summary
Ce travail décrit un protocole pour l’impression 3D intégrée de forme libre de cellules souches neurales à l’intérieur de composites de matrice particule-extracellulaire recuits auto-cicatrisants. Le protocole permet la structuration programmable de constructions de tissus neuraux humains interconnectés avec une haute fidélité.
Abstract
L’impression 3D intégrée de cellules à l’intérieur d’un support granulaire est apparue au cours de la dernière décennie comme une approche puissante pour la biofabrication de formes libres de constructions de tissus mous. Cependant, les formulations de gel granulaire ont été limitées à un nombre limité de biomatériaux qui permettent la génération rentable de grandes quantités de microparticules d’hydrogel. Par conséquent, les milieux de support de gel granulaire n’ont généralement pas les fonctions adhésives cellulaires et instructives cellulaires trouvées dans la matrice extracellulaire native (ECM).
Pour résoudre ce problème, une méthodologie a été développée pour la génération de composites à matrice extracellulaire recuite auto-cicatrisante (SHAPE). Les composites SHAPE se composent d’une phase granulaire (microgels) et d’une phase continue (solution ECM visqueuse) qui, ensemble, permettent à la fois une impression haute fidélité programmable et un environnement extracellulaire biofonctionnel réglable. Ce travail décrit comment la méthodologie développée peut être utilisée pour la biofabrication précise de constructions neuronales humaines.
Tout d’abord, les microparticules d’alginate, qui servent de composant granulaire dans les composites SHAPE, sont fabriquées et combinées avec un composant continu à base de collagène. Ensuite, des cellules souches neurales humaines sont imprimées à l’intérieur du matériau de support, suivies du recuit du support. Les constructions imprimées peuvent être maintenues pendant des semaines pour permettre la différenciation des cellules imprimées en neurones. Simultanément, la phase continue de collagène permet la croissance axonale et l’interconnexion des régions. Enfin, ce travail fournit des informations sur la façon d’effectuer l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes et l’immunocytochimie pour caractériser les constructions neuronales humaines imprimées en 3D.
Introduction
L’impression 3D précise et programmable de constructions d’hydrogel chargées de cellules qui imitent les tissus mous in vitro présente un défi majeur. Par exemple, les tentatives basées sur l’extrusion directe d’hydrogels mous sont intrinsèquement problématiques, car les mauvaises propriétés mécaniques requises pour récapituler le microenvironnement in vivo entraînent un manque d’intégrité structurelle, des déformations des caractéristiques prédéfinies ou l’effondrement complet des structures fabriquées. Une solution de contournement conventionnelle pour ce problème consiste à imprimer un échafaudage de support à partir d’un matériau biocompatible plus rigide qui permet à la construction finale de conserver sa forme. Cependant, cette approche limite considérablement les possibilités de conception et nécessite un réglage rhéologique minutieux des encres adjacentes.
Pour surmonter les limites de l’impression 3D traditionnelle par extrusion couche par couche, l’impression 3D intégrée est apparue ces dernières années comme une alternative puissante pour la fabrication de matériaux mous et de tissus 1,2,3,4,5,6. Au lieu d’extruder l’encre dans l’air ambiant sur une surface, l’encre est directement déposée à travers une aiguille de seringue à l’intérieur d’un bain de support qui est solide au repos, mais fluidifie de manière réversible autour de la pointe de l’aiguille mobile pour permettre le dépôt précis d’un matériau chargé de cellules molles. Le matériau déposé est maintenu en place pendant que le support se resolidifie dans le sillage de l’aiguille. En tant que telle, l’impression 3D intégrée permet la fabrication libre haute résolution de structures complexes à partir de biomatériaux mous avec des possibilités de conception étendues 7,8.
Les gels granulaires ont été largement explorés comme matériaux de bain de support pour l’impression 3D intégrée, car ils peuvent être formulés pour présenter des transitions solide-liquide lisses, localisées et réversibles à des contraintes de faible rendement 9,10,11. Bien qu’ils présentent d’excellentes propriétés rhéologiques pour l’impression haute résolution, les gels granulaires ont été limités à une poignée de biomatériaux12. Le manque de diversité dans les formulations de gel granulaire, qui est particulièrement évident si l’on considère la large gamme de biomatériaux disponibles pour les formulations d’hydrogel en vrac, est causé par la nécessité de générer de manière rentable un grand nombre de microgels en utilisant des chimies simples. En raison du paysage biomatériau limité des supports de gel granulaire, le réglage du microenvironnement extracellulaire fourni par le support d’impression présente un défi sur le terrain.
Récemment, une approche modulaire a été développée pour la génération de supports d’impression 3D intégrés, appelés composites à matrice extracellulaire recuite auto-cicatrisante (SHAPE)13. Cette approche combine les propriétés rhéologiques distinctes des gels granulaires avec la polyvalence biofonctionnelle des formulations d’hydrogel en vrac. Le support composite SHAPE présenté est constitué de microparticules d’alginate emballées (phase granulaire, ~70% de fraction volumique) avec un espace interstitiel accru rempli d’une solution de prégel ECM visqueuse à base de collagène (phase continue, ~30% fraction volumique). Il a en outre été démontré que le support SHAPE facilite le dépôt à haute résolution de cellules souches neurales humaines (hNSC) qui, après le recuit du bain de support, peuvent être différenciées en neurones et maintenues pendant des semaines pour atteindre la maturation fonctionnelle. L’impression 3D intégrée à l’intérieur du bain de support SHAPE surmonte certaines des principales limitations liées aux techniques conventionnelles de biofabrication de tissus neuraux tout en offrant une plate-forme polyvalente.
Ce travail détaille les étapes de l’impression 3D intégrée des CSNh à l’intérieur du support SHAPE et leur différenciation ultérieure en neurones fonctionnels (Figure 1). Tout d’abord, les microparticules d’alginate sont générées par cisaillement lors de la gélification interne. Cette approche permet de générer facilement de grands volumes de microparticules sans avoir besoin d’équipement spécialisé et de réactifs cytotoxiques. En outre, l’alginate est une source de matériaux largement disponible et économique pour la formation de substrats d’hydrogel biocompatibles pour une gamme variée de types de cellules. Les microparticules d’alginate générées sont combinées avec une solution de collagène pour former le matériau de support composite SHAPE. Ensuite, les hNSC sont récoltés et chargés dans une seringue en tant que bio-encre cellulaire pour l’impression 3D. Une bio-imprimante 3D est utilisée pour l’impression embarquée par extrusion de hNSCs à l’intérieur du composite SHAPE. Les cellules imprimées en 3D sont différenciées en neurones pour donner lieu à des constructions neuronales humaines fonctionnelles et spatialement définies. Enfin, le protocole décrit comment les constructions tissulaires générées peuvent être caractérisées à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes et de l’immunocytochimie. De plus, des conseils d’optimisation et de dépannage sont fournis. Notamment, les composants des phases granulaire et continue pourraient être échangés avec d’autres formulations d’hydrogel pour s’adapter à différentes fractions biofonctionnelles, propriétés mécaniques et mécanismes de réticulation, comme l’exigent d’autres types de cellules et de tissus au-delà des applications neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche des matériaux composites SHAPE offre une voie polyvalente pour la formulation de bains de support recuits et biofonctionnels pour l’impression 3D intégrée d’encres cellulaires. Bien que ce protocole fournisse un exemple d’impression 3D de constructions neuronales, la boîte à outils SHAPE pourrait facilement être adaptée à la biofabrication avec d’autres sources cellulaires pour l’ingénierie précise d’une gamme de types de tissus cibles. L’approche d’impression permettrait également…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche a été principalement financée par le programme Horizon 2020 de l’Union européenne BrainMatTrain (n° H2020-MSCA-ITN-2015) dans le cadre du réseau de formation initiale Marie Skłodowska-Curie et de la convention de subvention n° 676408. C.R. et J.U.L. tiennent à remercier la Fondation Lundbeck (R250-2017-1425) et le Fonds de recherche indépendant du Danemark (8048-00050) pour leur soutien. Nous remercions le projet HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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