Microgel-ekstracellulær matrise komposittstøtte for innebygd 3D-utskrift av menneskelige nevrale konstruksjoner
Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for friform innebygd 3D-utskrift av nevrale stamceller i selvhelbredende glødbare partikkel-ekstracellulære matrikskompositter. Protokollen muliggjør programmerbar mønstre av sammenkoblede menneskelige nevrale vevskonstruksjoner med høy troskap.
Abstract
Den innebygde 3D-utskriften av celler inne i et granulært støttemedium har dukket opp det siste tiåret som en kraftig tilnærming for freeform biofabrication av bløtvevskonstruksjoner. Imidlertid har granulære gelformuleringer vært begrenset til et begrenset antall biomaterialer som muliggjør kostnadseffektiv generering av store mengder hydrogelmikropartikler. Derfor har granulære gelstøttemedier generelt manglet de celleklebende og celleinstruktive funksjonene som finnes i den opprinnelige ekstracellulære matrisen (ECM).
For å løse dette er det utviklet en metodikk for generering av selvhelbredende glødbare partikkel-ekstracellulære matrisekompositter (SHAPE). SHAPE-kompositter består av en granulær fase (mikrogeler) og en kontinuerlig fase (tyktflytende ECM-løsning) som sammen muliggjør både programmerbar hi-fi-utskrift og et justerbart biofunksjonelt ekstracellulært miljø. Dette arbeidet beskriver hvordan den utviklede metodikken kan utnyttes for presis biofabrikasjon av menneskelige nevrale konstruksjoner.
Først blir alginatmikropartikler, som tjener som den granulære komponenten i SHAPE-komposittene, fremstilt og kombinert med en kollagenbasert kontinuerlig komponent. Deretter skrives menneskelige nevrale stamceller inn i støttematerialet, etterfulgt av glødning av støtten. De trykte konstruksjonene kan opprettholdes i flere uker for å tillate differensiering av de trykte cellene i nevroner. Samtidig tillater kollagen kontinuerlig fase for aksonal utvekst og sammenkobling av regioner. Til slutt gir dette arbeidet informasjon om hvordan man utfører levende cellefluorescensavbildning og immunocytokjemi for å karakterisere de 3D-printede menneskelige nevrale konstruksjonene.
Introduction
Den presise og programmerbare 3D-utskriften av cellebelastede hydrogelkonstruksjoner som etterligner bløtvev in vitro , utgjør en stor utfordring. For eksempel er forsøk basert på direkte ekstrudering av myke hydrogeler iboende problematiske, da de dårlige mekaniske egenskapene som kreves for å rekapitulere in vivo-mikromiljøet fører til mangel på strukturell integritet, deformasjoner av de forhåndsdefinerte egenskapene eller fullstendig sammenbrudd av de fabrikkerte strukturer. En vanlig løsning på dette problemet er å skrive ut et støttestillas fra et stivere biokompatibelt materiale som gjør at den endelige konstruksjonen kan opprettholde formen. Imidlertid begrenser denne tilnærmingen i stor grad designmulighetene og krever nøye reologisk finjustering av de tilstøtende blekkene.
For å overvinne begrensningene i den tradisjonelle lag-for-lag ekstruderingsbaserte 3D-utskriften, har innebygd 3D-utskrift dukket opp de siste årene som et kraftig alternativ for mykt materiale og vevfabrikasjon 1,2,3,4,5,6. I stedet for å ekstrudere blekket i omgivelsesluft på toppen av en overflate, blir blekket direkte avsatt gjennom en sprøytenål inne i et støttebad som er solid-lignende i ro, men reversibelt fluidiserer rundt den bevegelige nålespissen for å tillate presis avsetning av mykt cellebelastet materiale. Det deponerte materialet holdes på plass ettersom støtten størkner i kjølvannet av nålen. Som sådan tillater innebygd 3D-utskrift høyoppløselig friformfabrikasjon av intrikate strukturer fra myke biomaterialer med utvidede designmuligheter 7,8.
Granulære geler har blitt grundig utforsket som støttebadematerialer for innebygd 3D-utskrift, siden de kan formuleres for å vise jevne, lokaliserte og reversible faststoff-til-væske-overganger ved lave flytespenninger 9,10,11. Mens de viser gode reologiske egenskaper for høyoppløselig utskrift, har granulære geler blitt begrenset til en håndfull biomaterialer12. Mangelen på mangfold i granulære gelformuleringer, noe som er spesielt tydelig hvis man vurderer det brede spekteret av biomaterialer som er tilgjengelige for bulkhydrogelformuleringer, skyldes behovet for kostnadseffektiv generering av et stort antall mikrogeler ved bruk av enkle kjemikalier. På grunn av det begrensede biomateriallandskapet av granulære gelstøtter, utgjør innstillingen av det ekstracellulære mikromiljøet fra utskriftsstøtten en utfordring i feltet.
Nylig har en modulær tilnærming blitt utviklet for generering av innebygde 3D-utskriftsstøtter, kalt selvhelbredende glødbar partikkel-ekstracellulær matrise (SHAPE) kompositter13. Denne tilnærmingen kombinerer de distinkte reologiske egenskapene til granulære geler med den biofunksjonelle allsidigheten til bulkhydrogelformuleringer. Den presenterte SHAPE-komposittstøtten består av pakkede alginatmikropartikler (granulær fase, ~ 70% volumfraksjon) med et økt interstitielt rom fylt med en viskøs kollagenbasert ECM-pregelløsning (kontinuerlig fase, ~ 30% volumfraksjon). Det har videre vist seg at SHAPE-støtten muliggjør høyoppløselig avsetning av humane nevrale stamceller (hNSC) som, etter glødning av støttebadet, kan differensieres til nevroner og opprettholdes i flere uker for å nå funksjonell modning. Innebygd 3D-utskrift inne i SHAPE-støttebadet overvinner noen av de største begrensningene knyttet til konvensjonelle teknikker for biofabrikasjon av nevrale vev, samtidig som det gir en allsidig plattform.
Dette arbeidet beskriver trinnene for innebygd 3D-utskrift av hNSCs inne i SHAPE-støtten og deres påfølgende differensiering til funksjonelle nevroner (figur 1). Først genereres alginatmikropartikler via skjæring under intern gelering. Denne tilnærmingen tillater enkel generering av store mengder mikropartikler uten behov for spesialutstyr og cytotoksiske reagenser. Videre er alginat en allment tilgjengelig og økonomisk materialkilde for dannelse av biokompatible hydrogelsubstrater for et mangfoldig utvalg av celletyper. De genererte alginatmikropartiklene kombineres med en kollagenløsning for å danne SHAPE komposittstøttemateriale. Deretter høstes hNSC-ene og lastes inn i en sprøyte som et cellulært bioblekk for 3D-utskrift. En 3D-bioprinter brukes til ekstruderingsbasert innebygd utskrift av hNSC-er inne i SHAPE-kompositten. De 3D-printede cellene er differensiert i nevroner for å gi opphav til romlig definerte og funksjonelle menneskelige nevrale konstruksjoner. Til slutt beskriver protokollen hvordan de genererte vevskonstruksjonene kan karakteriseres ved hjelp av levende celleavbildning og immunocytokjemi. I tillegg gis tips for optimalisering og feilsøking. Spesielt kan både komponentene i de granulære og kontinuerlige fasene byttes ut med andre hydrogelformuleringer for å imøtekomme forskjellige biofunksjonelle deler, mekaniske egenskaper og tverrbindingsmekanismer, som kreves av andre celle- og vevstyper utover nevrale applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
SHAPE-tilnærmingen med komposittmaterialer gir en allsidig måte å formulere glødbare og biofunksjonelle støttebad for innebygd 3D-utskrift av cellulært blekk. Selv om denne protokollen gir et eksempel på 3D-utskrift av nevrale konstruksjoner, kan SHAPE-verktøykassen lett tilpasses biofabrikasjon med andre cellekilder for nøyaktig prosjektering av en rekke målvevstyper. Utskriftsmetoden vil også tillate nøyaktig mønster av flere celletyper for å studere deres interaksjon eller å konstruere vev med et define…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen ble primært finansiert av BrainMatTrain European Union Horizon 2020 Programme (nr. H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska- Curie Initial Training Network og Grant Agreement No. 676408. C.R. og J.U.L. takker Lundbeckstiftelsen (R250-2017-1425) og Danmarks uavhengige forskningsfond (8048-00050) for deres støtte. Vi takker for finansiering av HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01-prosjektet 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
