Microgel-extracellulär matriskompositstöd för inbäddad 3D-utskrift av mänskliga neurala konstruktioner
Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för friformsinbäddad 3D-utskrift av neurala stamceller inuti självläkande annealable partikel-extracellulära matriskompositer. Protokollet möjliggör programmerbar mönstring av sammankopplade mänskliga neurala vävnadskonstruktioner med hög trohet.
Abstract
Den inbäddade 3D-utskriften av celler inuti ett granulärt stödmedium har uppstått under det senaste decenniet som ett kraftfullt tillvägagångssätt för friformsbiofabricering av mjukvävnadskonstruktioner. Granulära gelformuleringar har dock begränsats till ett begränsat antal biomaterial som möjliggör kostnadseffektiv generering av stora mängder hydrogelmikropartiklar. Därför har granulära gelstödmedier i allmänhet saknat de celladhesiva och cellinstruerande funktionerna som finns i den ursprungliga extracellulära matrisen (ECM).
För att ta itu med detta har en metod utvecklats för generering av självläkande annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) kompositer. SHAPE-kompositer består av en granulär fas (mikrogeler) och en kontinuerlig fas (viskös ECM-lösning) som tillsammans möjliggör både programmerbar hifi-utskrift och en justerbar biofunktionell extracellulär miljö. Detta arbete beskriver hur den utvecklade metodiken kan användas för exakt biofabrikation av mänskliga neurala konstruktioner.
Först tillverkas alginatmikropartiklar, som fungerar som den granulära komponenten i SHAPE-kompositerna, och kombineras med en kollagenbaserad kontinuerlig komponent. Därefter trycks mänskliga neurala stamceller inuti stödmaterialet, följt av glödgning av stödet. De tryckta konstruktionerna kan bibehållas i veckor för att möjliggöra differentiering av de tryckta cellerna till neuroner. Samtidigt möjliggör den kollagenkontinuerliga fasen axonal utväxt och sammankoppling av regioner. Slutligen ger detta arbete information om hur man utför fluorescensavbildning med levande celler och immunocytokemi för att karakterisera de 3D-tryckta mänskliga neurala konstruktionerna.
Introduction
Den exakta och programmerbara 3D-utskriften av cellbelastade hydrogelkonstruktioner som efterliknar mjuka vävnader in vitro utgör en stor utmaning. Till exempel är försök baserade på direkt extrudering av mjuka hydrogeler i sig problematiska, eftersom de dåliga mekaniska egenskaperna som krävs för att rekapitulera in vivo-mikromiljön leder till brist på strukturell integritet, deformationer av de fördefinierade egenskaperna eller fullständig kollaps av de tillverkade strukturerna. En konventionell lösning på det här problemet är att skriva ut en stödjande ställning från ett styvare biokompatibelt material som gör att den slutliga konstruktionen kan behålla sin form. Detta tillvägagångssätt begränsar emellertid designmöjligheterna kraftigt och kräver noggrann reologisk finjustering av de intilliggande bläcken.
För att övervinna begränsningarna hos den traditionella lager-för-lager-extruderingsbaserade 3D-utskriften har inbäddad 3D-utskrift dykt upp de senaste åren som ett kraftfullt alternativ för mjuk material– och vävnadstillverkning 1,2,3,4,5,6. Istället för att extrudera bläcket i omgivande luft ovanpå en yta, deponeras bläcket direkt genom en sprutnål inuti ett stödbad som är fast som i vila men reversibelt flyter runt den rörliga nålspetsen för att möjliggöra exakt avsättning av mjukt cellbelastat material. Det deponerade materialet hålls på plats när stödet stelnar i nålens kölvatten. Som sådan möjliggör inbäddad 3D-utskrift högupplöst friformstillverkning av invecklade strukturer från mjuka biomaterial med utökade designmöjligheter 7,8.
Granulära geler har undersökts i stor utsträckning som stödbadmaterial för inbäddad 3D-utskrift, eftersom de kan formuleras för att uppvisa släta, lokaliserade och reversibla övergångar från fast till vätska vid låga avkastningsspänningar 9,10,11. Medan de visar utmärkta reologiska egenskaper för högupplöst utskrift har granulära geler begränsats till en handfull biomaterial12. Bristen på mångfald i granulära gelformuleringar, vilket är särskilt uppenbart om man beaktar det stora utbudet av biomaterial som finns tillgängliga för bulkhydrogelformuleringar, orsakas av behovet av kostnadseffektiv generering av ett stort antal mikrogeler med enkla kemier. På grund av det begränsade biomateriallandskapet för granulära gelstöd utgör inställningen av den extracellulära mikromiljön som tillhandahålls av tryckstödet en utmaning i fältet.
Nyligen har ett modulärt tillvägagångssätt utvecklats för generering av inbäddade 3D-utskriftsstöd, kallade självläkande annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) kompositer13. Detta tillvägagångssätt kombinerar de distinkta reologiska egenskaperna hos granulära geler med den biofunktionella mångsidigheten hos bulkhydrogelformuleringar. Det presenterade SHAPE-kompositstödet består av packade alginatmikropartiklar (granulär fas, ~ 70% volymfraktion) med ett ökat interstitiellt utrymme fyllt med en viskös kollagenbaserad ECM-pregellösning (kontinuerlig fas, ~ 30% volymfraktion). Det har vidare visats att SHAPE-stödet underlättar högupplöst deponering av humana neurala stamceller (hNSC) som efter glödgning av stödbadet kan differentieras till neuroner och bibehållas i veckor för att nå funktionell mognad. Inbäddad 3D-utskrift inuti SHAPE-stödbadet övervinner några av de största begränsningarna relaterade till konventionella tekniker för biofabrikation av neural vävnad samtidigt som den ger en mångsidig plattform.
Detta arbete beskriver stegen för inbäddad 3D-utskrift av hNSC inuti SHAPE-stödet och deras efterföljande differentiering till funktionella neuroner (figur 1). Först genereras alginatmikropartiklar via skjuvning under intern gelering. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel generering av stora volymer mikropartiklar utan behov av specialutrustning och cytotoxiska reagens. Dessutom är alginat en allmänt tillgänglig och ekonomisk materialkälla för bildning av biokompatibla hydrogelsubstrat för ett brett spektrum av celltyper. De genererade alginatmikropartiklarna kombineras med en kollagenlösning för att bilda SHAPE-kompositstödmaterialet. Därefter skördas hNSC: erna och laddas i en spruta som ett cellulärt biobläck för 3D-utskrift. En 3D-bioprinter används för extruderingsbaserad inbäddad utskrift av hNSC inuti SHAPE-kompositen. De 3D-utskrivna cellerna differentieras till neuroner för att ge upphov till rumsligt definierade och funktionella mänskliga neurala konstruktioner. Slutligen beskriver protokollet hur de genererade vävnadskonstruktionerna kan karakteriseras med hjälp av levande cellavbildning och immunocytokemi. Dessutom ges tips för optimering och felsökning. I synnerhet kan både komponenterna i de granulära och kontinuerliga faserna bytas ut med andra hydrogelformuleringar för att rymma olika biofunktionella delar, mekaniska egenskaper och tvärbindningsmekanismer, vilket krävs av andra cell- och vävnadstyper utöver neurala applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
SHAPE-kompositmaterialmetoden ger en mångsidig väg för formulering av annealbara och biofunktionella stödbad för inbäddad 3D-utskrift av cellulära bläck. Medan detta protokoll ger ett exempel på 3D-utskrift av neurala konstruktioner, kan SHAPE-verktygslådan enkelt anpassas till biofabrikation med andra cellkällor för exakt konstruktion av en rad målvävnadstyper. Utskriftsmetoden skulle också möjliggöra exakt mönstring av flera celltyper för att studera deras interaktion eller för att konstruera vävna…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen finansierades främst av BrainMatTrain European Union Horizon 2020 Programme (No. H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network och bidragsavtal nr 676408. C.R. och J.U.L. vill tacka Lundbeck Foundation (R250-2017-1425) och Independent Research Fund Denmark (8048-00050) för deras stöd. Vi tar tacksamt emot finansiering för projektet HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
