Soporte compuesto de matriz extracelular de microgel para la impresión 3D integrada de construcciones neuronales humanas
Summary
Este trabajo describe un protocolo para la impresión 3D incrustada de forma libre de células madre neurales dentro de compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autocurables. El protocolo permite el patrón programable de construcciones de tejido neural humano interconectadas con alta fidelidad.
Abstract
La impresión 3D integrada de células dentro de un medio de soporte granular ha surgido en la última década como un enfoque poderoso para la biofabricación de forma libre de construcciones de tejidos blandos. Sin embargo, las formulaciones de gel granular se han restringido a un número limitado de biomateriales que permiten la generación rentable de grandes cantidades de micropartículas de hidrogel. Por lo tanto, los medios de soporte de gel granular generalmente han carecido de las funciones adhesivas e instructivas celulares que se encuentran en la matriz extracelular nativa (ECM).
Para abordar esto, se ha desarrollado una metodología para la generación de compuestos de matriz extracelular de partículas recleables autorreparables (SHAPE). Los compuestos SHAPE consisten en una fase granular (microgeles) y una fase continua (solución ECM viscosa) que, juntas, permiten tanto la impresión programable de alta fidelidad como un entorno extracelular biofuncional ajustable. Este trabajo describe cómo se puede utilizar la metodología desarrollada para la biofabricación precisa de construcciones neuronales humanas.
En primer lugar, las micropartículas de alginato, que sirven como componente granular en los compuestos SHAPE, se fabrican y combinan con un componente continuo a base de colágeno. Luego, las células madre neurales humanas se imprimen dentro del material de soporte, seguido del recocido del soporte. Las construcciones impresas se pueden mantener durante semanas para permitir la diferenciación de las células impresas en neuronas. Simultáneamente, la fase continua de colágeno permite el crecimiento axonal y la interconexión de regiones. Finalmente, este trabajo proporciona información sobre cómo realizar imágenes de fluorescencia de células vivas e inmunocitoquímica para caracterizar las construcciones neuronales humanas impresas en 3D.
Introduction
La impresión 3D precisa y programable de construcciones de hidrogel cargadas de células que imitan los tejidos blandos in vitro presenta un gran desafío. Por ejemplo, los intentos basados en la extrusión directa de hidrogeles blandos son inherentemente problemáticos, ya que las pobres propiedades mecánicas requeridas para recapitular el microambiente in vivo conducen a una falta de integridad estructural, deformaciones de las características predefinidas o el colapso completo de las estructuras fabricadas. Una solución convencional para este problema es imprimir un andamio de soporte a partir de un material biocompatible más rígido que permita que la construcción final mantenga su forma. Sin embargo, este enfoque limita en gran medida las posibilidades de diseño y requiere un cuidadoso ajuste reológico de las tintas adyacentes.
Para superar las limitaciones de la impresión 3D tradicional basada en extrusión capa por capa, la impresión 3D integrada ha surgido en los últimos años como una poderosa alternativa para la fabricación de materiales blandos y tejidos 1,2,3,4,5,6. En lugar de extruir la tinta en el aire ambiente sobre una superficie, la tinta se deposita directamente a través de una aguja de jeringa dentro de un baño de soporte que es sólido en reposo, pero se fluidiza reversiblemente alrededor de la punta de la aguja en movimiento para permitir la deposición precisa de material cargado de células blandas. El material depositado se mantiene en su lugar a medida que el soporte se resolidifica en la estela de la aguja. Como tal, la impresión 3D integrada permite la fabricación de forma libre de alta resolución de estructuras intrincadas a partir de biomateriales blandos con posibilidades de diseño ampliadas 7,8.
Los geles granulares se han explorado ampliamente como materiales de baño de soporte para la impresión 3D integrada, ya que pueden formularse para exhibir transiciones suaves, localizadas y reversibles de sólido a líquido a bajas tensiones de rendimiento 9,10,11. Si bien muestran excelentes propiedades reológicas para la impresión de alta resolución, los geles granulares se han restringido a un puñado de biomateriales12. La falta de diversidad en las formulaciones de gel granular, que es particularmente evidente si se considera la amplia gama de biomateriales disponibles para formulaciones de hidrogel a granel, se debe a la necesidad de generar una gran cantidad de microgeles utilizando químicos simples. Debido al limitado panorama biomaterial de los soportes de gel granular, el ajuste del microambiente extracelular proporcionado por el soporte de impresión presenta un desafío en el campo.
Recientemente, se ha desarrollado un enfoque modular para la generación de soportes de impresión 3D integrados, denominados compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autorreparables (SHAPE)13. Este enfoque combina las distintas propiedades reológicas de los geles granulares con la versatilidad biofuncional de las formulaciones de hidrogel a granel. El soporte compuesto SHAPE presentado consiste en micropartículas de alginato empaquetadas (fase granular, fracción de volumen ~70%) con un espacio intersticial aumentado lleno de una solución de pregel ECM a base de colágeno viscoso (fase continua, fracción de volumen ~30%). Además, se ha demostrado que el soporte SHAPE facilita la deposición de alta resolución de células madre neurales humanas (hNSC) que, después del recocido del baño de soporte, pueden diferenciarse en neuronas y mantenerse durante semanas para alcanzar la maduración funcional. La impresión 3D integrada dentro del baño de soporte SHAPE supera algunas de las principales limitaciones relacionadas con las técnicas convencionales para la biofabricación de tejidos neuronales al tiempo que proporciona una plataforma versátil.
Este trabajo detalla los pasos para la impresión 3D embebida de hNSCs dentro del soporte SHAPE y su posterior diferenciación en neuronas funcionales (Figura 1). En primer lugar, las micropartículas de alginato se generan mediante cizallamiento durante la gelificación interna. Este enfoque permite la fácil generación de grandes volúmenes de micropartículas sin necesidad de equipos especializados y reactivos citotóxicos. Además, el alginato es una fuente de material ampliamente disponible y económica para la formación de sustratos de hidrogel biocompatibles para una amplia gama de tipos de células. Las micropartículas de alginato generadas se combinan con una solución de colágeno para formar el material de soporte compuesto SHAPE. Luego, las hNSC se cosechan y se cargan en una jeringa como una biotinta celular para la impresión 3D. Una bioimpresora 3D se utiliza para la impresión integrada basada en extrusión de hNSC dentro del compuesto SHAPE. Las células impresas en 3D se diferencian en neuronas para dar lugar a construcciones neuronales humanas espacialmente definidas y funcionales. Finalmente, el protocolo describe cómo se pueden caracterizar las construcciones de tejido generado utilizando imágenes de células vivas e inmunocitoquímica. Además, se proporcionan consejos para la optimización y la solución de problemas. En particular, tanto los componentes de la fase granular como la continua podrían intercambiarse con otras formulaciones de hidrogel para acomodar diferentes restos biofuncionales, propiedades mecánicas y mecanismos de reticulación, según lo requerido por otros tipos de células y tejidos más allá de las aplicaciones neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque de material compuesto SHAPE proporciona una ruta versátil para la formulación de baños de soporte recocibles y biofuncionales para la impresión 3D incrustada de tintas celulares. Si bien este protocolo proporciona un ejemplo de la impresión 3D de construcciones neuronales, la caja de herramientas SHAPE podría adaptarse fácilmente a la biofabricación con otras fuentes celulares para la ingeniería precisa de una gama de tipos de tejidos objetivo. El enfoque de impresión también permitiría el patrón …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación fue financiada principalmente por el Programa BrainMatTrain Horizon 2020 de la Unión Europea (No. H2020-MSCA-ITN-2015) bajo la Red de Formación Inicial Marie Skłodowska-Curie y el Acuerdo de Subvención No. 676408. C.R. y J.U.L. desean agradecer a la Fundación Lundbeck (R250-2017-1425) y al Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca (8048-00050) por su apoyo. Agradecemos la financiación del proyecto HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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