유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공
Summary
영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.
Abstract
대뇌 피질은 가장 바깥쪽 뇌 구조이며 감각 입력 및 운동 출력 처리를 담당합니다. 그것은 포유류, 특히 영장류에서 고차원인지 능력의 자리로 간주됩니다. 영장류의 뇌에서 유전자 기능을 연구하는 것은 기술적, 윤리적 이유로 인해 어려운 일이지만, 뇌 오가노이드 기술의 확립은 전통적인 영장류 모델(예: 붉은털 원숭이 및 일반 마모셋)뿐만 아니라 이전에는 실험적으로 접근할 수 없었던 영장류 종(예: 유인원)에서 윤리적으로 정당하고 기술적으로 덜 까다로운 시스템. 또한, 인간의 뇌 오가노이드는 신경 발달 및 신경 장애에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.
뇌 오가노이드는 뇌 발달의 많은 과정을 요약하기 때문에 진화적 맥락에서 다양한 종의 뇌 발달의 기초가 되는 유전적 결정 요인의 차이점을 식별하고 기능적으로 비교할 수 있는 강력한 도구이기도 합니다. 오가노이드 사용의 가장 큰 장점은 유전자 기능을 테스트할 수 있는 유전자 변형을 도입할 수 있다는 것입니다. 그러나 이러한 수정의 도입은 힘들고 비용이 많이 듭니다. 이 논문은 뇌 오가노이드의 하위 유형인 영장류 대뇌 오가노이드의 심실과 같은 구조 내에서 세포 집단을 유전적으로 변형하는 빠르고 비용 효율적인 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 인간, 침팬지, 붉은털원숭이 및 일반 마모셋 유래 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드의 안정적인 생성을 위한 수정된 프로토콜을 미세주입 및 전기천공 접근법과 결합합니다. 이것은 질병 모델링에도 적용할 수 있는 신경 발달 및 진화 과정 연구를 위한 효과적인 도구를 제공합니다.
Introduction
대뇌 피질의 (병리) 생리적 발달과 진화를 조사하는 것은 적절한 모델 시스템의 부족으로 인해 방해받는 엄청난 작업입니다. 이전에는 이러한 연구가 2차원 세포 배양 모델(예: 1차 신경 전구체 또는 신경 세포 배양)과 진화적으로 멀리 떨어진 동물 모델(예: 설치류)에 국한되었습니다1,2. 이러한 모델은 특정 질문을 해결하는 데 유용하지만 건강 및 질병 상태에서 발달 중인 인간 신피질의 복잡성, 세포 유형 구성, 세포 구조 및 유전자 발현 패턴을 모델링하는 데는 제한적입니다. 이러한 제한은 예를 들어 소두증의 특정 사례에 대해 설명된 바와 같이 인간 질병의 마우스 모델을 인간 상황에 대한 열악한 번역 가능성으로 이끕니다(예: Zhang et al.3). 최근에, 인간 신피질 발달의 진화학적, 기능적, 형태학적으로 더 가까운 모델인 형질전환 비인간 영장류가 세포 배양 및 설치류 기반 모델의 많은 한계를 극복함에따라 4,5,6,7,8에 초점이 맞춰졌습니다. 그러나 연구에 인간이 아닌 영장류를 사용하는 것은 비용과 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 윤리적 문제를 제기합니다. 보다 최근에, 뇌 오가노이드 기술(9,10)의 개발은 이전 모델(11,12,13,14,15,16)의 많은 한계를 해결하는 유망한 대안으로 부상했다.
뇌 오가노이드는 정의된 발달 시간 창 11,12,13,14,17 동안 하나 또는 여러 뇌 영역의 세포 구조 및 세포 유형 구성의 주요 특징을 모방하는 3차원(3D) 다세포 구조입니다. 이러한 3D 구조는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 관심 종에 사용할 수 있는 경우 배아 줄기 세포(ESC)에서 생성됩니다. 일반적으로, 두 종류의 뇌 오가노이드가 사용된 방법론에 기초하여 구별될 수 있다: 비유도 및 국소화된(guided) 뇌 오가노이드18. 후자의 유형의 오가노이드를 생성할 때, 만능 줄기 세포를 특정 뇌 영역의 오가노이드(예: 전뇌 오가노이드)로 분화시키는 것을 안내하는 소분자 또는 인자가 제공됩니다18. 대조적으로, 유도되지 않은 오가노이드에서 분화는 작은 분자의 추가에 의해 유도되는 것이 아니라 iPSC/ESC의 자발적인 분화에만 전적으로 의존합니다. 생성된 뇌 오가노이드는 서로 다른 뇌 영역(예: 대뇌 오가노이드)을 나타내는 세포 유형으로 구성됩니다18. 뇌 오가노이드는 뇌 발달의 많은 주요 특징과 iPSC 또는 ESC를 사용할 수 있는 모든 관심 종에서 상대적으로 비용 및 시간 효율적인 생성을 결합합니다11,12,13,14. 따라서 뇌 오가노이드는 진화 및 발달 문제에서 질병 모델링 및 약물 테스트에 이르기까지 다양한 종류의 신경생물학적 연구를 위한 훌륭한 모델이 됩니다15,16. 그러나 뇌 오가노이드를 사용하여 이러한 문제를 해결하는 것은 유전자 변형을 위한 다양한 방법의 가용성에 크게 의존합니다.
신피질(병리)생리학적 발달과 그 진화를 연구하는 한 가지 핵심 측면은 유전자와 유전자 변이체의 기능적 분석입니다. 이것은 일반적으로 (이소성) 발현 및/또는 해당 유전자의 녹다운(KD) 또는 녹아웃(KO)에 의해 달성됩니다. 이러한 유전자 변형은 안정적이고 일시적인 유전자 변형뿐만 아니라 시간적 및 공간적으로 제한되거나 제한되지 않는 변형으로 분류될 수 있습니다. 안정적인 유전자 변형은 모든 후속 세포 세대에 전달되는 숙주 게놈에 유전적 변형을 도입하는 것으로 정의됩니다. 유전자 변형의 시점에 따라 오가노이드의 모든 세포에 영향을 미치거나 특정 세포 집단으로 제한될 수 있습니다. 가장 빈번하게, 렌티바이러스, 트랜스포존 유사 시스템 및 CRISPR/Cas9 기술을 적용하여 iPSC/ESC 수준에서 뇌 오가노이드에서 안정적인 유전자 변형이 달성됩니다(예: Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 및 Teriyapirom et al.20). 이것은 뇌 오가노이드의 모든 세포가 유전자 변형을 가지고 있으며 시간적으로나 공간적으로 제한되지 않는다는 장점이 있습니다. 그러나 이러한 안정적인 iPSC/ESC 라인의 생성 및 특성화는 매우 시간이 많이 소요되며, 첫 번째 변형된 뇌 오가노이드를 분석할 수 있을 때까지 종종 몇 개월이 걸립니다(예: Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 또는 Teriyapirom et al.20에 의해 검토됨).
대조적으로, 일시적인 유전자 변형은 숙주 게놈 내로 통합되지 않는 유전자 화물(예를 들어, 유전자 발현 플라스미드)의 전달에 의해 정의된다. 이 변형은 원칙적으로 후속 세포 세대로 전달될 수 있지만, 전달된 유전 화물은 각 세포 분열에 따라 점진적으로 희석됩니다. 따라서 이러한 유형의 유전자 변형은 일반적으로 시간적, 공간적으로 제한됩니다. 일시적인 유전자 변형은 아데노 관련 바이러스 또는 전기천공에 의해 뇌 오가노이드에서 수행될 수 있으며(예: Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 및 Teriyapirom et al.20에 의해 검토됨), 후자는 이 기사에서 자세히 설명합니다. 안정적인 유전자 변형과 달리 이 접근 방식은 매우 빠르고 비용 효율적입니다. 실제로, 전기천공은 몇 분 이내에 수행될 수 있으며, 표적 세포 집단에 따라 전기천공된 오가노이드는 수일 이내에 분석 준비가 완료됩니다(예: Fischer et al.17 및 Kyrousi et al.19에 의해 검토됨). 그러나 크기의 차이와 같은 뇌 오가노이드의 전체적인 형태학적 변화는 이러한 유형의 유전자 변형이 시간적, 공간적으로 제한되기 때문에 이 방법을 사용하여 감지할 수 없습니다. 이러한 제한은 예를 들어 오가노이드 내의 개별 세포 집단을 연구하거나 특정 발달 시점에서 뇌 오가노이드에 미치는 영향을 연구하는 경우에도 이점이 될 수 있습니다(예: Fischer et al.17 및 Kyrousi et al.19에 의해 검토됨).
뇌 발달과 진화 과정에서 유전자 기능을 연구하는 고전적인 접근 방식은 자궁 전기 천공법입니다. 자궁 내 전기천공은 설치류 21,22,23 및 흰 족제비24,25 뇌에 유전자 발현 구조를 전달하는 데 잘 알려져 있고 유용한 기술입니다. 먼저, 관심있는 발현 구조체를 함유하는 용액을 자궁벽을 통해 표적화 할 영역에 따라 배아 뇌의 특정 심실에 미세 주입합니다. 두 번째 단계에서는 전기 펄스를 적용하여 표적 심실을 직접 감싸는 세포를 transfection합니다. 이 접근법은 이소성 발현 또는 유전자의 과발현에만 국한되지 않고 짧은 헤어핀(shRNA) 또는 CRISPR/Cas9(발현 플라스미드 또는 리보핵단백질[RNP]의 형태)를 각각 미세 주입하여 KD 또는 KO 연구에도 적용할 수 있습니다26,27. 그러나 마우스, 쥐 및 흰 족제비 배아의 자궁 내 전기천공법은 이러한 동물 모델에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 한계를 가지고 있습니다.
이상적으로는 영장류 에서 직접 자궁 전기 천공을 수행하고 싶습니다. 이것은 원칙적으로 기술적으로 가능하지만 자궁 내 전기 천공은 윤리적 문제, 높은 동물 유지 비용 및 작은 깔짚 크기로 인해 영장류에서 수행되지 않습니다. 유인원(인간 포함)과 같은 특정 영장류의 경우 이것은 전혀 불가능합니다. 그러나 이 영장류는 인간의 (병리)생리학적 신피질 발달과 그 진화를 연구할 수 있는 가장 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 딜레마에 대한 한 가지 해결책은 영장류 뇌 오가노이드에 전기천공 기술을 적용하는 것이다28.
이 논문은 영장류 뇌 오가노이드의 아형인 영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 오가노이드의 심실과 같은 구조 내에서 세포 집단의 빠르고 비용 효율적인 유전자 변형을 가능하게 합니다. 구체적으로, 우리는 인간(호모 사피엔스), 침팬지(Pan troglodytes), 붉은털 원숭이(Macaca mulatta) 및 일반 마모셋(Callithrix jacchus) iPSC에서 영장류 대뇌 오가노이드를 생성하기 위한 통합 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 미세주입 및 전기천공 기술을 자세히 설명하고 영장류 대뇌 오가노이드 전기천공을 수행하기 위한 “이동” 및 “금지” 기준을 제공합니다. 이 접근법은 특히 인간 상황에 가까운 모델에서 (병리) 생리적 신피질 발달과 그 진화를 연구하는 데 효과적인 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 절차는 표적 전기천공 접근법을 사용하여 다양한 영장류 종에서 대뇌 오가노이드를 생성하기 위한 통합 프로토콜을 나타냅니다. 이것은 영장류(인간 포함)(병리)생리학적 신피질 발달을 모방하는 모델 시스템에서 GOI의 이소성 발현을 허용합니다. 영장류 대뇌 오가노이드 생성을 위한 이 통합 프로토콜은 제시된 4가지 영장류 종 모두에 대해 동일한 재료(예: 배지) 및 프로토콜 단계…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
지면의 제약으로 인해 논문을 인용하지 못한 모든 연구자들에게 사과드립니다. 페트리 접시 전극 챔버 건설에 대해 DPZ의 기술 서비스 담당자인 Ulrich Bleyer와 MPI-CBG 워크숍의 Hartmut Wolf에게 감사드립니다. 인간(iLonza2.2), 붉은털 원숭이(iRh33.1) 및 마모셋(cj_160419_5) iPSC를 제공한 Stoyan Petkov 및 Rüdiger Behr; 동결절개 및 면역형광 염색을 위한 Sabrina Heide; 그리고 원고를 비판적으로 읽은 Neringa Liutikaite와 César Mateo Bastidas Betancourt. W.B.H. 실험실에서의 작업은 ERA-NET NEURON (MicroKin) 보조금으로 지원되었습니다. M.H.의 실험실에서의 작업은 ERC 시작 보조금 (101039421)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
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