Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie
Summary
De elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten biedt een nauwkeurige en efficiënte benadering om voorbijgaande genetische modificatie (s) te introduceren in verschillende voorlopertypen en neuronen in een modelsysteem dat dicht bij de ontwikkeling van primaat (patho) fysiologische neocortex ligt. Dit maakt de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen mogelijk en kan ook worden toegepast voor ziektemodellering.
Abstract
De hersenschors is de buitenste hersenstructuur en is verantwoordelijk voor de verwerking van sensorische input en motorische output; Het wordt gezien als de zetel van cognitieve vaardigheden van hogere orde bij zoogdieren, in het bijzonder primaten. Het bestuderen van genfuncties in primatenhersenen is een uitdaging vanwege technische en ethische redenen, maar de oprichting van de hersenorganoïde technologie heeft de studie van de hersenontwikkeling mogelijk gemaakt in traditionele primatenmodellen (bijv. Resusapen en gewone marmoset), evenals in voorheen experimenteel ontoegankelijke primatensoorten (bijv. Mensapen), in een ethisch verantwoord en minder technisch veeleisend systeem. Bovendien maken menselijke hersenorganoïden het geavanceerde onderzoek van neurologische en neurologische aandoeningen mogelijk.
Omdat hersenorganoïden veel processen van hersenontwikkeling samenvatten, vormen ze ook een krachtig hulpmiddel om verschillen in de genetische determinanten die ten grondslag liggen aan de hersenontwikkeling van verschillende soorten in een evolutionaire context te identificeren en functioneel te vergelijken. Een groot voordeel van het gebruik van organoïden is de mogelijkheid om genetische modificaties te introduceren, waardoor genfuncties kunnen worden getest. De introductie van dergelijke wijzigingen is echter arbeidsintensief en duur. Dit artikel beschrijft een snelle en kostenefficiënte benadering van het genetisch modificeren van celpopulaties binnen de ventrikelachtige structuren van cerebrale organoïden van primaten, een subtype van hersenorganoïden. Deze methode combineert een aangepast protocol voor de betrouwbare generatie van cerebrale organoïden uit mens-, chimpansee-, rhesusmakaak- en gewone marmoset-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met een microinjectie- en elektroporatiebenadering. Dit biedt een effectief hulpmiddel voor de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen die ook kunnen worden toegepast voor ziektemodellering.
Introduction
Het onderzoeken van de (patho)fysiologische ontwikkeling en evolutie van de hersenschors is een formidabele taak die wordt belemmerd door het ontbreken van geschikte modelsystemen. Voorheen waren dergelijke studies beperkt tot tweedimensionale celkweekmodellen (zoals primaire neurale voorloper- of neuronale celculturen) en evolutionair verre diermodellen (zoals knaagdieren)1,2. Hoewel deze modellen nuttig zijn voor het beantwoorden van bepaalde vragen, zijn ze beperkt in het modelleren van de complexiteit, celtypesamenstelling, cellulaire architectuur en genexpressiepatronen van de zich ontwikkelende menselijke neocortex in gezonde en zieke toestanden. Deze beperkingen leiden bijvoorbeeld tot de slechte vertaalbaarheid van muismodellen van menselijke ziekten naar de menselijke situatie, zoals beschreven voor bepaalde gevallen van microcefalie (bijv. Zhang et al.3). Onlangs zijn transgene niet-menselijke primaten, die een evolutionair, functioneel en morfologisch dichterbij model van menselijke neocortexontwikkeling zijn, in beeld gekomen 4,5,6,7,8 omdat ze veel beperkingen van op celcultuur en knaagdieren gebaseerde modellen overwinnen. Het gebruik van niet-menselijke primaten in onderzoek is echter niet alleen zeer duur en tijdrovend, maar roept ook ethische bezwaren op. Meer recent is de ontwikkeling van hersenorganoïde technologie 9,10 naar voren gekomen als een veelbelovend alternatief dat veel van de beperkingen van eerdere modellen 11,12,13,14,15,16 oplost.
Hersenorganoïden zijn driedimensionale (3D), meercellige structuren die de belangrijkste kenmerken van de cytoarchitectuur en celtypesamenstelling van een of meerdere hersengebieden nabootsen voor een gedefinieerd ontwikkelingstijdvenster 11,12,13,14,17. Deze 3D-structuren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) of, indien beschikbaar voor de betrokken soort, uit embryonale stamcellen (SER’s). Over het algemeen kunnen twee soorten hersenorganoïden worden onderscheiden op basis van de gebruikte methodologie: ongeleide en geregionaliseerde (geleide) hersenorganoïden18. Bij het genereren van het laatste type organoïden worden kleine moleculen of factoren verstrekt die de differentiatie van de pluripotente stamcellen naar organoïden van een bepaald hersengebied (bijv. Voorhersenen organoïden) sturen)18. Bij ongeleide organoïden daarentegen wordt de differentiatie niet geleid door de toevoeging van kleine moleculen, maar berust deze uitsluitend op de spontane differentiatie van de iPSC’s/SER’s. De resulterende hersenorganoïden bestaan uit celtypen die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen (bijvoorbeeld cerebrale organoïden)18. Hersenorganoïden combineren veel belangrijke kenmerken van hersenontwikkeling met relatief kosten- en tijdefficiënte generatie van elke soort van belang waarvoor iPSC’s of SER’s beschikbaar zijn11,12,13,14. Dit maakt hersenorganoïden een uitstekend model voor vele soorten neurobiologische studies, variërend van evolutionaire en ontwikkelingsvragen tot ziektemodellering en medicijntesten15,16. Het beantwoorden van dergelijke vragen met behulp van hersenorganoïden hangt echter sterk af van de beschikbaarheid van verschillende methoden voor genetische modificatie.
Een belangrijk aspect van het bestuderen van neocortex (patho)fysiologische ontwikkeling en de evolutie ervan is de functionele analyse van genen en genvarianten. Dit wordt meestal bereikt door (ectopische) expressie en/of door knock-down (KD) of knock-out (KO) van die genen. Dergelijke genetische modificaties kunnen worden ingedeeld in stabiele en voorbijgaande genetische modificatie, evenals in de modificaties die tijdelijk en ruimtelijk beperkt zijn of niet beperkt zijn. Stabiele genetische modificatie wordt gedefinieerd door de introductie van een genetische verandering in het gastheergenoom die wordt doorgegeven aan alle volgende celgeneraties. Afhankelijk van het tijdstip van genetische modificatie kan het alle cellen van een organoïde beïnvloeden of kan het worden beperkt tot bepaalde celpopulaties. Meestal wordt stabiele genetische modificatie bereikt in hersenorganoïden op iPSC / ESC-niveau door lentivirussen, transposon-achtige systemen en de CRISPR / Cas9-technologie toe te passen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 en Teriyapirom et al.20). Dit heeft als voordeel dat alle cellen van de hersenorganoïde de genetische modificatie dragen en dat deze niet tijdelijk of ruimtelijk beperkt is. Het genereren en karakteriseren van deze stabiele iPSC/ESC-lijnen is echter zeer tijdrovend en duurt vaak enkele maanden voordat de eerste gemodificeerde hersenorganoïden kunnen worden geanalyseerd (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 of Teriyapirom et al.20).
Daarentegen wordt voorbijgaande genetische modificatie gedefinieerd door de levering van genetische lading (bijvoorbeeld een genexpressieplasmide) die niet integreert in het gastheergenoom. Hoewel deze modificatie in principe kan worden doorgegeven aan volgende celgeneraties, zal de geleverde genetische lading bij elke celdeling geleidelijk worden verdund. Daarom is dit type genetische modificatie meestal tijdelijk en ruimtelijk beperkt. Voorbijgaande genetische modificatie kan worden uitgevoerd in hersenorganoïden door adeno-geassocieerde virussen of door elektroporatie (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 en Teriyapirom et al.20), waarbij de laatste in detail wordt beschreven in dit artikel. In tegenstelling tot stabiele genetische modificatie is deze aanpak zeer snel en kostenefficiënt. Inderdaad, elektroporatie kan binnen enkele minuten worden uitgevoerd en, afhankelijk van de doelcelpopulatie (en), zijn geëlektroporeerde organoïden binnen enkele dagen klaar voor analyse (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et al.19). Grove morfologische veranderingen van de hersenorganoïde, zoals verschillen in grootte, kunnen echter niet worden gedetecteerd met deze methode, omdat dit type genetische modificatie tijdelijk en ruimtelijk beperkt is. Deze beperking kan ook een voordeel zijn, bijvoorbeeld in het geval van het bestuderen van individuele celpopulaties binnen de organoïde of de effecten op hersenorganoïden op specifieke ontwikkelingstijdstippen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et al.19).
Een klassieke benadering om de genfunctie tijdens de ontwikkeling en evolutie van de hersenen te bestuderen, is in utero-elektroporatie. In utero is elektroporatie een bekende en bruikbare techniek voor de afgifte van genexpressieconstructen in knaagdier 21,22,23 en fret 24,25 hersenen. Ten eerste wordt een oplossing met de expressieconstructie(s) van belang micro-geïnjecteerd door de baarmoederwand in een bepaalde ventrikel van de embryonale hersenen, afhankelijk van het te richten gebied. In de tweede stap worden elektrische pulsen toegepast om de cellen direct langs de beoogde ventrikel te transfecteren. Deze benadering is niet alleen beperkt tot ectopische expressie of de overexpressie van genen, omdat het ook kan worden toegepast in KD- of KO-studies door micro-injecterende korte haarspeld (shRNA) of CRISPR / Cas9 (in de vorm van expressieplasmiden of ribonucleoproteïnen [RNP’s]), respectievelijk26,27. De in utero elektroporatie van muizen-, ratten- en frettenembryo’s heeft echter dezelfde beperkingen als hierboven beschreven voor deze diermodellen.
Idealiter zou men in utero elektroporatie direct bij primaten willen uitvoeren. Hoewel dit in principe technisch mogelijk is, wordt elektroporatie in utero niet uitgevoerd bij primaten vanwege ethische overwegingen, hoge onderhoudskosten voor dieren en kleine worpgroottes. Voor bepaalde primaten, zoals mensapen (inclusief mensen), is dit helemaal niet mogelijk. Deze primaten hebben echter het grootste potentieel voor de studie van de menselijke (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan. Een oplossing voor dit dilemma is om de elektroporatietechniek toe te passen op primatenhersenorganoïden28.
Dit artikel presenteert een protocol voor de elektroporatie van een subtype van primaat hersenorganoïden, primaten cerebrale organoïden. Deze aanpak maakt de snelle en kostenefficiënte genetische modificatie van celpopulaties binnen de ventrikelachtige structuren van de organoïden mogelijk. In het bijzonder beschrijven we een uniform protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van primaten van menselijke (Homo sapiens), chimpansee (Pan troglodytes), resusaap (Macaca mulatta) en gewone marmoset (Callithrix jacchus) iPSC’s. Bovendien beschrijven we de micro-injectie- en elektroporatietechniek in detail en bieden we “go” en “no-go” -criteria voor het uitvoeren van cerebrale organoïde elektroporatie van primaten. Deze benadering is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van de (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan in een model dat bijzonder dicht bij de menselijke situatie staat.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedures vertegenwoordigen een uniform protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van verschillende primatensoorten met een gerichte elektroporatiebenadering. Dit maakt de ectopische expressie van een Indonesische overheid mogelijk in een modelsysteem dat de ontwikkeling van primaten (inclusief menselijke) (patho)fysiologische neocortex emuleert. Dit uniforme protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van primaten maakt gebruik van dezelfde materialen (bijv. Media) en protocolst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We verontschuldigen ons bij alle onderzoekers wiens werk niet kon worden geciteerd vanwege ruimtebeperkingen. Wij danken Ulrich Bleyer van de technische dienst van DPZ en Hartmut Wolf van de werkplaats van MPI-CBG voor de bouw van de petrischaalelektrodekamers; Stoyan Petkov en Rüdiger Behr voor het verstrekken van menselijke (iLonza2.2), resusapen (iRh33.1) en marmoset (cj_160419_5) iPSC’s; Sabrina Heide voor de cryosectieing en immunofluorescentiekleuring; en Neringa Liutikaite en César Mateo Bastidas Betancourt voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk in het laboratorium van W.B.H. werd ondersteund door een ERA-NET NEURON (MicroKin) subsidie. Het werk in het laboratorium van M.H. werd ondersteund door een ERC starting grant (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
