جيل سايبريد ناقل الغضروف باستخدام خطوط الخلايا السرطانية
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية لتوليد السايبريد من الخلايا السرطانية المعلقة كأداة لدراسة دور الميتوكوندريا في عملية الورم.
Abstract
في السنوات الأخيرة ، ارتفع عدد الدراسات المخصصة للتأكد من العلاقة بين الميتوكوندريا والسرطان بشكل كبير. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لفهم العلاقة التي تنطوي على تغييرات في الميتوكوندريا وتكوين الأورام بشكل كامل ، وكذلك لتحديد الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا المرتبطة بالورم. على سبيل المثال ، لتقييم مساهمة الميتوكوندريا في عمليات تكوين الأورام وورم خبيث ، من الضروري فهم تأثير الميتوكوندريا من الخلايا السرطانية في البيئات النووية المختلفة. لهذا الغرض ، يتمثل أحد الأساليب الممكنة في نقل الميتوكوندريا إلى خلفية نووية مختلفة للحصول على ما يسمى بالخلايا السايبريدية. في تقنيات cybridization التقليدية ، يتم إعادة ملء خط الخلية الذي يفتقر إلى mtDNA (ρ0 ، خلية مانحة نووية) بالميتوكوندريا المشتقة من الخلايا المنزوعة النواة أو الصفائح الدموية. ومع ذلك ، تتطلب عملية الاستئصال التصاق جيد للخلايا بلوحة المزرعة ، وهي ميزة تفقد جزئيا أو كليا في كثير من الحالات في الخلايا الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك صعوبة أخرى موجودة في الطرق التقليدية وهي تحقيق الإزالة الكاملة ل mtDNA الداخلي من خط الخلية المتلقي للميتوكوندريا للحصول على خلفيات الحمض النووي والميتوكوندريا النقية ، وتجنب وجود نوعين مختلفين من mtDNA في cybrid المتولد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول تبادل الميتوكوندريا المطبق على الخلايا السرطانية المعلقة النمو بناء على إعادة توطين الخلايا المعالجة مسبقا للرودامين 6G مع الميتوكوندريا المعزولة. تسمح لنا هذه المنهجية بالتغلب على قيود الأساليب التقليدية ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتوسيع فهم دور الميتوكوندريا في تطور السرطان وورم خبيث.
Introduction
إعادة برمجة استقلاب الطاقة هو السمة المميزة للسرطان1 التي لوحظت لأول مرة من قبل أوتو واربورغ في ثلاثينيات القرن العشرين2. في ظل الظروف الهوائية ، تقوم الخلايا الطبيعية بتحويل الجلوكوز إلى بيروفات ، والتي تولد بعد ذلك أسيتيل-CoA ، مما يغذي آلية الميتوكوندريا ويعزز التنفس الخلوي. ومع ذلك ، أظهر واربورغ أنه حتى في ظل الظروف المعيارية ، تقوم معظم الخلايا السرطانية بتحويل البيروفات التي تم الحصول عليها من عملية تحلل السكر إلى لاكتات ، وتحول طريقها للحصول على الطاقة. يعرف هذا التعديل الأيضي باسم “تأثير واربورغ” ويمكن بعض الخلايا السرطانية من توفير مطالبها النشطة للنمو السريع والانقسام ، على الرغم من توليد ATP بكفاءة أقل من العملية الهوائية3،4،5. في العقود الأخيرة ، دعمت العديد من الأعمال الآثار المترتبة على إعادة برمجة الأيض في تطور السرطان. وبالتالي ، تعتبر طاقة الورم هدفا مثيرا للاهتمام ضد السرطان1. كمحور مركزي في التمثيل الغذائي النشط وفي توريد السلائف الأساسية ، تلعب الميتوكوندريا دورا رئيسيا في هذه التكيفات الخلوية التي ، حتى الآن ، نفهمها جزئيا فقط.
تماشيا مع ما سبق ، تم اقتراح طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) كأحد الأسباب المحتملة لإعادة البرمجة الأيضية هذه ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ضعف أداء سلسلة نقل الإلكترون (ETC)6 وستفسر سبب تعزيز بعض الخلايا السرطانية لعملية التمثيل الغذائي للسكر للبقاء على قيد الحياة. في الواقع ، تم الإبلاغ عن أن mtDNA يتراكم الطفرات داخل الخلايا السرطانية ، حيث يوجد في 50٪ على الأقل من الأورام7. على سبيل المثال ، أفادت دراسة حديثة أجراها Yuan et al. بوجود جزيئات mtDNA مفرطة التحور والمقطوعة في سرطان الكلى والقولون والمستقيم والغدة الدرقية8. علاوة على ذلك ، أثبتت العديد من الأعمال أن بعض طفرات mtDNA مرتبطة بنمط ظاهري أكثر عدوانية للورم ومع زيادة في الإمكانات النقيلية للخلايا السرطانية9،10،11،12،13،14،15،16.
على الرغم من الأهمية الواضحة لجينوم الميتوكوندريا في تطور السرطان ، فإن دراسة هذه الطفرات ومساهمتها في المرض كانت صعبة بسبب القيود في النماذج والتقنيات التجريبية المتاحة حاليا17. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لفهم التأثير الحقيقي للحمض النووي للميتوكوندريا في تطور مرض السرطان وتطوره. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتوليد cybrid transmitochondrial من الخلايا السرطانية المعلقة النمو ، استنادا إلى إعادة توطين خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا مع الميتوكوندريا المعزولة ، والتي تتغلب على التحديات الرئيسية لطرق cybridization التقليدية18,19. تسمح هذه المنهجية باستخدام أي متبرع بالنوى بغض النظر عن توفر خط الخلية ρ0 المقابل ونقل الميتوكوندريا من الخلايا التي ، باتباع التقنيات التقليدية ، سيكون من الصعب استئصالها (أي خطوط الخلايا غير الملتصقة).
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ أن أفاد أوتو واربورغ أن الخلايا السرطانية تحول عملية التمثيل الغذائي وتحفز “تحلل السكر الهوائي”3,4 مع تقليل تنفس الميتوكوندريا ، نما الاهتمام بدور الميتوكوندريا في تحول السرطان وتطوره بشكل كبير. في السنوات الأخيرة ، تم افتراض الطفرات في mtDNA واختلال المي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من خلال المنحة رقم PID2019-105128RB-I00 إلى RSA و JMB و AA ، و PGC2018-095795-B-I00 إلى PFS و RML ، وكلاهما ممول من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 وأرقام المنح B31_20R (RSA و JMA و AA) و E35_17R (PFS و RML) وبتمويل من Gobierno de Aragón. وحظي عمل الرابطة بدعم من منحة من الرابطة الإسبانية لمكافحة الكانسر PRDAR21487SOLE. ويود المؤلفان أن يعربا عن تقديرهما لاستخدام الخدمة العامة للدعم والتحقيق في الأجهزة العليا للرقابة المالية، جامعة سرقسطة.
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
