Transmitochondrial Cybrid Generation ved hjælp af kræftcellelinjer

Summary

Denne protokol beskriver en teknik til cybridgenerering fra suspensionsvoksende kræftceller som et værktøj til at studere mitokondriernes rolle i den tumorigene proces.

Abstract

I de senere år er antallet af undersøgelser dedikeret til at fastslå forbindelsen mellem mitokondrier og kræft steget betydeligt. Der er dog stadig behov for en større indsats for fuldt ud at forstå linket, der involverer ændringer i mitokondrier og tumorgenese, samt at identificere tumorassocierede mitokondriefænotyper. For eksempel for at evaluere mitokondriernes bidrag i tumorigenese og metastaseprocesser er det vigtigt at forstå mitokondriernes indflydelse fra tumorceller i forskellige nukleare miljøer. Til dette formål består en mulig tilgang i at overføre mitokondrier til en anden nuklear baggrund for at opnå de såkaldte cybridceller. I de traditionelle cybridiseringsteknikker genbefolkes en cellelinje, der mangler mtDNA (ρ⁰, nuklear donorcelle) med mitokondrier afledt af enten enukleerede celler eller blodplader. Imidlertid kræver enukleationsprocessen god celleadhæsion til kulturpladen, en funktion, der i mange tilfælde helt eller delvist går tabt i invasive celler. Derudover er en anden vanskelighed, der findes i de traditionelle metoder, at opnå fuldstændig fjernelse af det endogene mtDNA fra mitokondrie-modtagercellelinjen for at opnå ren nuklear og mitokondriel DNA-baggrund, idet man undgår tilstedeværelsen af to forskellige mtDNA-arter i den genererede cybrid. I dette arbejde præsenterer vi en mitokondrieudvekslingsprotokol anvendt på suspensionsvoksende kræftceller baseret på genpopulation af rhodamin 6G-forbehandlede celler med isolerede mitokondrier. Denne metode giver os mulighed for at overvinde begrænsningerne i de traditionelle tilgange og kan således bruges som et redskab til at udvide forståelsen af mitokondrierollen i kræftprogression og metastase.

Introduction

Omprogrammering af energimetabolisme er et kendetegn ved kræft¹, der blev observeret for første gang af Otto Warburg i 1930’erne². Under aerobe forhold omdanner normale celler glukose til pyruvat, der derefter genererer acetyl-coA, der brænder mitokondriemaskineriet og fremmer cellulær respiration. Ikke desto mindre demonstrerede Warburg, at selv under normokiske forhold omdanner de fleste kræftceller pyruvat opnået fra glykolyseprocessen til lactat og skifter deres måde at opnå energi på. Denne metaboliske justering er kendt som “Warburg-effekten” og gør det muligt for nogle kræftceller at levere deres energiske behov for hurtig vækst og deling, på trods af at de genererer ATP mindre effektivt end den aerobe proces ^3,4,5. I de seneste årtier har adskillige værker støttet implikationen af metabolisme omprogrammering i kræftprogression. Derfor betragtes tumor energetik som et interessant mål mod kræft¹. Som et centralt knudepunkt i energisk metabolisme og i forsyningen af essentielle forstadier spiller mitokondrier en nøglerolle i disse celletilpasninger, som vi til dato kun delvist forstår.

I tråd med ovenstående er mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer blevet foreslået som en af de mulige årsager til denne metaboliske omprogrammering, hvilket kan føre til en nedsat elektrontransportkæde (ETC) ydeevne⁶ og ville forklare, hvorfor nogle kræftceller forbedrer deres glykolytiske metabolisme for at overleve. Faktisk er det blevet rapporteret, at mtDNA akkumulerer mutationer i kræftceller, der er til stede i mindst 50% af tumorer⁷. For eksempel rapporterede en nylig undersøgelse udført af Yuan et al. tilstedeværelsen af hypermuterede og afkortede mtDNA-molekyler i nyre-, kolorektal- og skjoldbruskkirtelkræft⁸. Desuden har mange værker vist, at visse mtDNA-mutationer er forbundet med en mere aggressiv tumorfænotype og med en stigning i kræftcellernes metastatiske potentiale 9,10,11,12,13,14,15,16.

På trods af mitokondriegenomets tilsyneladende relevans i kræftprogression har undersøgelsen af disse mutationer og deres bidrag til sygdommen været udfordrende på grund af begrænsninger i de eksperimentelle modeller og teknologier, der i øjeblikket er tilgængelige¹⁷. Derfor er der behov for nye teknikker til at forstå den reelle virkning af mitokondrie-DNA i udvikling og progression af kræftsygdomme. I dette arbejde introducerer vi en protokol for transmission af cybrid-generering fra suspensionsvoksende kræftceller baseret på genbefolkning af rhodamin 6G-forbehandlede celler med isolerede mitokondrier, der overvinder de største udfordringer ved traditionelle cybridiseringsmetoder^18,19. Denne metode tillader anvendelse af enhver kernedonor uanset tilgængeligheden af deres tilsvarende ρ 0-cellelinje og overførsel af mitokondrier fra celler, der efter de traditionelle teknikker ville være vanskelige at enukleere (dvs. ikke-klæbende cellelinjer).

Protocol

BEMÆRK: Alle kulturmedier og buffersammensætninger er specificeret i tabel 1. Før cybrid-generering skal både mitokondrie- og kerne-DNA-profiler fra donor- og modtagercellerne indtastes for at bekræfte tilstedeværelsen af genetiske forskelle i begge genomer mellem cellelinjer. I denne undersøgelse blev en kommercielt tilgængelig L929-cellelinje og dens afledte cellelinje, L929dt, som blev spontant genereret i vores laboratorium (se13 for mere information) brugt. Disse cell…

Representative Results

Efter at have fulgt ovennævnte protokol skal der opnås en homoplasmatisk cybridcellelinje med en bevaret nuklear baggrund, men med en ny mitokondriegenotype, som vist i skemaerne i figur 1 og figur 2. Renheden af mitokondrie- og nukleart DNA i cybriderne kan bekræftes ved RFLP, som vist i figur 3, og ved nuklear DNA-genotypeanalyse, som vist i figur 4. Hvis mitokondrieover…

Discussion

Siden Otto Warburg rapporterede, at kræftceller ændrer deres stofskifte og forstærker “aerob glykolyse”^3,4, samtidig med at mitokondriernes respiration reduceres^, er interessen for mitokondriernes rolle i kræfttransformation og progression vokset eksponentielt. I de senere år er mutationer i mtDNA og mitokondriel dysfunktion blevet postuleret som kendetegnende for mange kræfttyper²⁵. Til dato har adskillige undersøgelser analyseret …

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750