יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.
Abstract
בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.
Introduction
תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם “אפקט ורבורג” ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעשורים האחרונים, עבודות רבות תמכו במשמעות של תכנות מחדש של חילוף החומרים בהתקדמות הסרטן. לפיכך, אנרגיית הגידול נחשבת למטרה מעניינת נגד סרטן1. כמרכז מרכזי בחילוף חומרים אנרגטי ובאספקת מבשרים חיוניים, מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בהסתגלויות התאים הללו, שעד היום אנו מבינים רק באופן חלקי.
בהתאם לאמור לעיל, מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) הוצעו כאחד הגורמים האפשריים לתכנות מחדש מטבולי זה, אשר עלול להוביל לפגיעה בביצועי שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC)6 ויסבירו מדוע תאים סרטניים מסוימים משפרים את חילוף החומרים הגליקוליטי שלהם כדי לשרוד. ואכן, דווח כי mtDNA צובר מוטציות בתוך תאים סרטניים, להיות נוכח לפחות 50% של גידולים7. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על ידי יואן ואחרים דיווח על נוכחות של מולקולות mtDNA hypermutated וקטוע בסרטן הכליות, המעי הגס ובלוטת התריס8. יתר על כן, עבודות רבות הוכיחו כי מוטציות מסוימות mtDNA קשורות לפנוטיפ גידול אגרסיבי יותר ולעלייה בפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 9,10,11,12,13,14,15,16.
למרות הרלוונטיות לכאורה של הגנום המיטוכונדריאלי בהתקדמות הסרטן, המחקר של מוטציות אלה ותרומתן למחלה היה מאתגר בשל מגבלות במודלים ובטכנולוגיות הניסוי הזמינות כיום17. לכן, יש צורך בטכניקות חדשות כדי להבין את ההשפעה האמיתית של DNA מיטוכונדריה על התפתחות מחלות סרטן והתקדמותן. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף, המבוסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת, המתגבר על האתגרים העיקריים של שיטות גישור מסורתיות18,19. מתודולוגיה זו מאפשרת שימוש בכל תורם גרעינים ללא קשר לזמינות קו תאי ρ0 המתאים להם ולהעברת מיטוכונדריה מתאים אשר, בעקבות הטכניקות המסורתיות, יהיה קשה לחנך (כלומר, קווי תאים שאינם דבקים).
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים “גליקוליזה אירובית”3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי ש…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
