Генерация трансмитохондриальных цибридов с использованием линий раковых клеток
Summary
В этом протоколе описывается метод генерации цибрид из раковых клеток, растущих в суспензии, в качестве инструмента для изучения роли митохондрий в онкогенном процессе.
Abstract
В последние годы значительно возросло количество исследований, посвященных выяснению связи между митохондриями и раком. Тем не менее, все еще необходимы дополнительные усилия, чтобы полностью понять связь, связанную с изменениями в митохондриях и онкогенезе, а также для выявления митохондриальных фенотипов, связанных с опухолью. Например, чтобы оценить вклад митохондрий в процессы онкогенеза и метастазирования, важно понять влияние митохондрий опухолевых клеток в различных ядерных средах. Для этой цели один из возможных подходов состоит в переносе митохондрий в другой ядерный фон для получения так называемых клеток кибридов. В традиционных методах цибридизации клеточная линия, лишенная мтДНК (ρ0, ядерная донорская клетка), заселяется митохондриями, полученными либо из энуклеированных клеток, либо из тромбоцитов. Однако процесс энуклеации требует хорошей клеточной адгезии к культуральной пластине, особенность, которая частично или полностью теряется во многих случаях в инвазивных клетках. Кроме того, еще одна трудность, встречающаяся в традиционных методах, заключается в достижении полного удаления эндогенной мтДНК из клеточной линии митохондрий-реципиентов для получения чистых ядерных и митохондриальных фонов ДНК, избегая присутствия двух разных видов мтДНК в сгенерированном цибриде. В этой работе мы представляем протокол митохондриального обмена, применяемый к раковым клеткам, выращивающим суспензию, на основе репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями. Эта методология позволяет преодолеть ограничения традиционных подходов и, таким образом, может быть использована в качестве инструмента для расширения понимания роли митохондрий в прогрессировании рака и метастазировании.
Introduction
Перепрограммирование энергетического метаболизма является отличительной чертой рака1, который впервые наблюдался Отто Варбургом в 1930-х годах2. В аэробных условиях нормальные клетки превращают глюкозу в пируват, который затем генерирует ацетил-КоА, подпитывая митохондриальный механизм и способствуя клеточному дыханию. Тем не менее, Варбург продемонстрировал, что даже в нормоксических условиях большинство раковых клеток превращают пируват, полученный в процессе гликолиза, в лактат, изменяя свой путь к получению энергии. Эта метаболическая корректировка известна как «эффект Варбурга» и позволяет некоторым раковым клеткам удовлетворять свои энергетические потребности для быстрого роста и деления, несмотря на то, что генерация АТФ менее эффективна, чем аэробный процесс 3,4,5. В последние десятилетия многочисленные работы подтвердили влияние перепрограммирования метаболизма на прогрессирование рака. Следовательно, опухолевая энергетика считается интересной мишенью против рака1. Как центральный узел в энергетическом метаболизме и в поставке необходимых предшественников, митохондрии играют ключевую роль в этих клеточных адаптациях, которые на сегодняшний день мы понимаем лишь частично.
В соответствии с вышесказанным, мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) были предложены в качестве одной из возможных причин этого метаболического перепрограммирования, что может привести к нарушению производительности цепи переноса электронов (ETC)6 и объяснить, почему некоторые раковые клетки усиливают свой гликолитический метаболизм, чтобы выжить. Действительно, сообщалось, что мтДНК накапливает мутации в раковых клетках, присутствуя, по крайней мере, в 50% опухолей7. Например, в недавнем исследовании, проведенном Yuan et al., сообщалось о наличии гипермутированных и усеченных молекул мтДНК при раке почек, толстой кишки и щитовидной железы8. Более того, во многих работах было продемонстрировано, что определенные мутации мтДНК связаны с более агрессивным фенотипом опухоли и с увеличением метастатического потенциала раковых клеток 9,10,11,12,13,14,15,16.
Несмотря на очевидную значимость митохондриального генома в прогрессировании рака, изучение этих мутаций и их вклада в заболевание было сложным из-за ограничений в экспериментальных моделях и технологиях, доступных в настоящее время17. Таким образом, необходимы новые методы для понимания реального влияния митохондриальной ДНК на развитие и прогрессирование раковых заболеваний. В этой работе мы представляем протокол генерации трансмитохондриальных цибридов из раковых клеток, растущих в суспензии, основанный на репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями, что позволяет преодолеть основные проблемы традиционных методов кибридизации18,19. Эта методология позволяет использовать любого донора ядер независимо от наличия соответствующей им клеточной линии ρ0 и переноса митохондрий из клеток, которые, следуя традиционным методам, было бы трудно энуклеировать (т.е. неадгезивные клеточные линии).
Protocol
Representative Results
Discussion
С тех пор, как Отто Варбург сообщил, что раковые клетки изменяют свой метаболизм и потенцируют «аэробный гликолиз»3,4 при одновременном снижении митохондриального дыхания, интерес к роли митохондрий в трансформации и прогрессировании рака вырос в геомет…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось грантом No PID2019-105128RB-I00 для RSA, JMB и AA и PGC2018-095795-B-I00 для PFS и RML, оба финансировались MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 и грантами No B31_20R (RSA, JMA и AA) и E35_17R (PFS и RML) и финансировались Gobierno de Aragón. Работа ЮАР была поддержана грантом Испанской ассоциации против кансера (AECC) PRDAR21487SOLE. Авторы хотели бы отметить использование Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
