Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling
Summary
Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.
Abstract
Lipidedruppeltjes (LDs) zijn gespecialiseerde organellen die lipidenopslag bemiddelen en een zeer belangrijke rol spelen bij het onderdrukken van lipotoxiciteit en het voorkomen van disfunctie veroorzaakt door vrije vetzuren (VA’s). De lever, gezien zijn cruciale rol in het vetmetabolisme van het lichaam, wordt aanhoudend bedreigd door de intracellulaire accumulatie van LDs in de vorm van zowel microvesiculaire als macrovesiculaire hepatische steatose. De histologische karakterisering van LDs is meestal gebaseerd op lipide-oplosbare diazokleurstoffen, zoals Oil Red O (ORO) kleuring, maar een aantal nadelen belemmeren consequent het gebruik van deze analyse met levermonsters. Meer recent zijn lipofiele fluoroforen 493/503 populair geworden voor het visualiseren en lokaliseren van LDs vanwege hun snelle opname en accumulatie in de neutrale lipidedruppelkern. Hoewel de meeste toepassingen goed beschreven zijn in celculturen, is er minder bewijs dat het betrouwbare gebruik van lipofiele fluorofore sondes als LD-beeldvormingsinstrument in weefselmonsters aantoont. Hierin stellen we een geoptimaliseerd boordipyrrometheen (BODIPY) 493/503-gebaseerd protocol voor de evaluatie van LDs in levermonsters voor uit een diermodel van vetrijk dieet (HFD) -geïnduceerde hepatische steatose. Dit protocol heeft betrekking op levermonstervoorbereiding, weefselsectie, BODIPY 493/503-kleuring, beeldacquisitie en gegevensanalyse. We tonen een verhoogd aantal, intensiteit, oppervlakteverhouding en diameter van lever-LDs bij HFD-voeding. Met behulp van orthogonale projecties en 3D-reconstructies was het mogelijk om de volledige inhoud van neutrale lipiden in de LD-kern te observeren, die als bijna bolvormige druppels verschenen. Bovendien konden we met de fluorofoor BODIPY 493/503 microvesicles (1 μm < d ≤ 3 μm), tussenblaasjes (3 μm 9 μm) onderscheiden, waardoor de succesvolle discriminatie van microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk werd. Over het algemeen is dit op fluorescentie gebaseerde protocol van BODIPY 493/503 een betrouwbaar en eenvoudig hulpmiddel voor LD-karakterisering in de lever en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen.
Introduction
Lipidedruppels (LDs), klassiek gezien als energiedepots, zijn gespecialiseerde cellulaire organellen die lipidenopslag bemiddelen, en ze omvatten een hydrofobe neutrale lipidekern, die voornamelijk cholesterolesters en triglyceriden (TG’s) bevat, ingekapseld door een fosfolipide monolaag 1,2,3.
LD-biogenese vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER), te beginnen met de synthese van triacylglycerol (TAG) en sterolesters. Neutrale lipiden worden in lage concentraties verspreid tussen de blaadjes van de ER-dubbellaag, maar smelten samen tot olielenzen die groeien en toppen tot bijna bolvormige druppels van het ER-membraan wanneer hun intracellulaire concentratie toeneemt4. Vervolgens transloceren eiwitten uit de ER-dubbellaag en cytosol, met name de perilipine (PLIN) eiwitfamilie, naar de oppervlakken van de LDs omontluiking 5,6,7,8,9 te vergemakkelijken.
Door nieuwe vetzuursynthese en LD-fusie of coalescentie groeien LD’s in verschillende groottes. Dienovereenkomstig verschillen de grootte en het aantal LD’s aanzienlijk tussen verschillende celtypen. Kleine druppeltjes (300-800 nm diameter), die bekend staan als initiële LDs (iLDs), kunnen door bijna alle cellen worden gevormd4. Later in LD-vorming zijn de meeste cellen in staat om sommige iLDs om te zetten in grotere LDs (eLDs >1 μm in diameter). Toch hebben alleen specifieke celtypen, zoals adipocyten en hepatocyten, de capaciteit om gigantische of supersized LDs te vormen (tot tientallen microns in diameter)4,10.
LDs spelen een zeer belangrijke rol bij de regulatie van cellulair lipidenmetabolisme, het onderdrukken van lipotoxiciteit en het voorkomen van ER-stress, mitochondriale disfunctie en, uiteindelijk, celdood veroorzaakt door vrije vetzuren (FAs)11,12,13,14. Bovendien zijn LDs ook betrokken bij de regulatie van genexpressie, virale replicatie-eiwitsekwestratie en membraanhandel en signalering15,16,17. Daarom is de misregulatie van LD-biogenese een kenmerk van chronische ziekten geassocieerd met metabool syndroom, obesitas, type 2 diabetes mellitus (T2DM) en / of aderverkalking, om er maar een paar te noemen18,19,20.
De lever, als een metabole hub, is meestal verantwoordelijk voor het lipidenmetabolisme door lipiden op te slaan en te verwerken, en daarom wordt het voortdurend bedreigd door lipotoxiciteit21. Hepatische steatose (HS) is een gemeenschappelijk kenmerk van een reeks progressieve leverziekten en wordt gekenmerkt door overmatige intracellulaire lipideaccumulatie in de vorm van cytosolische LDs die uiteindelijk kunnen leiden tot leverstofwisselingsstoornissen, ontsteking en geavanceerde vormen van niet-alcoholische leververvetting22,23,24,25. HS treedt op wanneer de snelheid van vetzuuroxidatie en export als triglyceriden in lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL’s) lager is dan de snelheid van opname van levervetzuren uit het plasma en de novo vetzuursynthese26. De hepatische accumulatie van lipiden komt vaak voor in twee vormen – microvesiculaire en macrovesiculaire steatose – en deze vertonen verschillende cytoarchitectonische kenmerken27. Typisch wordt microvesiculaire steatose gekenmerkt door de aanwezigheid van kleine LDs verspreid over de hepatocyt met de kern centraal geplaatst, terwijl macrovesiculaire steatose wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een enkele grote LD die het grootste deel van de hepatocyt bezet, waardoor de kern naar de periferie wordt geduwd28,29. Met name deze twee soorten steatose worden vaak samen gevonden, en het blijft onduidelijk hoe deze twee LD-patronen de pathogenese van de ziekte beïnvloeden, omdat het bewijs nog steeds inconsistent is31,32,33,34. Toch wordt een dergelijk type analyse vaak gebruikt als een “referentiestandaard” in preklinische en klinische studies om het dynamische gedrag van LDs te begrijpen en hepatische steatose te karakteriseren 29,34,35,36.
Leverbiopten, de gouden standaard voor het diagnosticeren en beoordelen van HS, worden routinematig beoordeeld door histologische hematoxyline en eosine (H &E) analyse, waarbij lipidedruppels worden geëvalueerd als niet-gekleurde vacuolen in H & E-gekleurde leversecties37. Hoewel acceptabel voor macrovesiculaire steatose-evaluatie, beperkt dit type kleuring over het algemeen de beoordeling van microvesiculaire steatose38. Lipide-oplosbare diazokleurstoffen, zoals Oil Red O (ORO), worden klassiek gecombineerd met brightfieldmicroscopie om intracellulaire lipidenvoorraden te analyseren, maar deze hebben nog steeds een aantal nadelen: (i) het gebruik van ethanol of isopropanol in het kleuringsproces, wat vaak de verstoring van de inheemse LDs en occasionele fusie veroorzaakt, ondanks dat de cellen worden gefixeerd39; ii) het tijdrovende karakter, aangezien de ORO-oplossing vanwege de beperkte houdbaarheid moet worden opgelost en gefiltreerd door vers poeder, wat bijdraagt tot minder consistente resultaten; (iii) en het feit dat ORO meer kleurt dan alleen lipidedruppeltjes en vaak hepatische steatose overschat38.
Bijgevolg zijn celdoorlatende lipofiele fluoroforen, zoals Nile Red, gebruikt in levende of vaste monsters om enkele van de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. De niet-specifieke aard van cellulaire lipideorganeletikettering vernauwt echter herhaaldelijk LD-beoordelingen40. Bovendien variëren de spectrale eigenschappen van Nijlrood afhankelijk van de polariteit van de omgeving, wat vaak kan leiden tot spectrale verschuivingen41.
De lipofiele fluorescerende sonde 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceen (excitatiegolflengte: 480 nm; emissiemaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) vertoont hydrofobiciteitskenmerken die een snelle opname door intracellulaire LDs mogelijk maken, zich ophopen in de lipidedruppelkern en vervolgens heldergroene fluorescentie uitzenden12. In tegenstelling tot Nile Red is BODIPY 493/503 ongevoelig voor de omgevingspolariteit en is aangetoond dat het selectiever is, omdat het een hoge helderheid weergeeft voor LD-beeldvorming. Om neutrale LDs te kleuren, kan deze kleurstof worden gebruikt in levende of vaste cellen en met succes worden gekoppeld aan andere kleurings- en / of etiketteringsmethoden42. Een ander voordeel van de kleurstof is dat het weinig moeite kost om in een oplossing te plaatsen en stabiel is, waardoor het niet nodig is om het voor elk experiment vers te bereiden42. Hoewel de BODIPY 493/503-sonde met succes is gebruikt om de lokalisatie en dynamiek van LDs in celculturen te visualiseren, hebben sommige rapporten ook het betrouwbare gebruik van deze kleurstof aangetoond als een LD-beeldvormingstool in weefsels, waaronder de menselijke vastus lateralis-spier43, de rat soleus-spier 42 en de muizendarm44.
Hierin stellen we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503-gebaseerd protocol voor als een alternatieve analytische benadering voor de evaluatie van het LD-aantal, het gebied en de diameter in levermonsters van een diermodel van leversteatose. Deze procedure omvat de voorbereiding van levermonsters, weefselsecties, kleuringscondities, beeldacquisitie en gegevensanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit op fluorescentie gebaseerde protocol van BODIPY 493/503 voor LD-beoordeling had tot doel een nieuwe beeldvormingsbenadering te ontwikkelen voor de evaluatie van leversteatose. Gezien de sterke correlatie tussen obesitas en leververvetting, werd het vetrijke dieet in westerse stijl gebruikt om een diermodel van leversteatose vast te stellen26. Een robuuste toename van het lever-TG-gehalte werd bevestigd door een kwantitatieve triglyceriden colorimetrische testkit, die een verhoogd leverlipidose…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door nationale en Europese fondsen via de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER) en Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) en POCI-01-0145-FEDER-007440. De auteurs willen graag de steun van iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, een faciliteit van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van Coimbra en een lid van de nationale infrastructuur PPBI-Portugese Platform van BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), evenals de steun van FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142 bedanken.
Materials
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. , 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R., Yang, H., Li, P. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. , 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J., Muriel, P. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. , 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G., Saxena, R. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). , 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What’s new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
