Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen
Summary
Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN).
Abstract
Genoomwijde analyses met kleincellige populaties zijn een belangrijke beperking voor studies, met name op het gebied van stamcellen. Dit werk beschrijft een efficiënt protocol voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van satellietcellen uit de ledemaatspier, een weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. Ontlede ledemaatspieren van volwassen muizen werden mechanisch verstoord door fijnhakken in medium aangevuld met dispase en type I collagenase. Na de spijsvertering werd het homogenaat gefilterd door celzeven en werden de cellen gesuspendeerd in de FACS-buffer. De levensvatbaarheid werd bepaald met een fixeerbare levensvatbaarheidskleuring en immunogekleurde satellietcellen werden geïsoleerd door FACS. Cellen werden gelyseerd met Triton X-100 en vrijgekomen kernen werden gebonden aan concanavalin A magnetische kralen. Kern/kraalcomplexen werden geïncubeerd met antilichamen tegen de transcriptiefactor of histonmodificaties van belang. Na wasbeurten werden kern/kraalcomplexen geïncubeerd met proteïne A-microkokkennuclease en werd chromatinesplitsing geïnitieerd met CaCl2. Na DNA-extractie werden bibliotheken gegenereerd en gesequenced, en de profielen voor genoombrede transcriptiefactorbinding en covalente histonmodificaties werden verkregen door bio-informatica-analyse. De pieken die voor de verschillende histonmarkeringen werden verkregen, toonden aan dat de bindingsgebeurtenissen specifiek waren voor satellietcellen. Bovendien onthulde bekende motiefanalyse dat de transcriptiefactor gebonden was aan chromatine via het verwante responselement. Dit protocol is daarom aangepast om genregulatie te bestuderen in spiercellen van volwassen muizen.
Introduction
Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam1. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen2. In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen3 noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels4. Er werd gemeld dat ze het cluster van differentiatie 34 (CD34; een hematopoëtische, endotheliale voorloper en mesenchymale stamcelmarker), integrine alfa 7 (ITGA7; een gladde, hart- en skeletspiermarker) tot expressie brachten, evenals de C-X-C chemokinereceptor type 4 (CXCR4; een lymfocyt-, hematopoëtische en satellietcelmarker)5. In basale omstandigheden bevinden satellietcellen zich in een bepaalde micro-omgeving die ze in een rusttoestand houdt6. Bij spierbeschadiging worden ze geactiveerd, vermenigvuldigen ze zich en ondergaan ze myogenese7. Omdat ze echter slechts een klein deel van het totale aantal spiercellen uitmaken, zijn hun genoombrede analyses bijzonder uitdagend, vooral onder fysiologische omstandigheden (<1% van het totale aantal cellen).
Er zijn verschillende methoden beschreven voor chromatine-isolatie uit satellietcellen, waarbij chromatine-immunoprecipitatie wordt gevolgd door massale parallelle sequencing (ChIP-seq) of splitsing onder doelen en tagmentatie-experimenten (CUT&Tag). Desalniettemin hebben deze twee technieken enkele belangrijke beperkingen die onbetwist blijven. ChIP-seq vereist inderdaad een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal om voldoende chromatine te genereren, waarvan een groot deel verloren gaat tijdens de sonicatiestap. CUT&Tag is meer geschikt voor een laag celaantal, maar genereert meer off-target splitsingsplaatsen dan ChIP-seq vanwege de Tn5-transposase-activiteit. Bovendien, aangezien dit enzym een hoge affiniteit heeft voor open-chromatineregio’s, kan de CUT&Tag-benadering bij voorkeur worden gebruikt voor het analyseren van histonmodificaties of transcriptiefactoren die verband houden met actief getranscribeerde regio’s van het genoom, in plaats van tot zwijgen gebracht heterochromatine 8,9.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen door FACS mogelijk maakt voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN)10,11-analyse. De verschillende stappen omvatten de mechanische verstoring van weefsel, celsortering en kernisolatie. De efficiëntie van de methode, met betrekking tot de bereiding van een levensvatbare celsuspensie, werd aangetoond door het uitvoeren van CUT&RUN-analyse voor covalente histonmodificaties en transcriptiefactoren. De kwaliteit van geïsoleerde cellen maakt de beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine dat de oorspronkelijke genomische bezettingstoestand getrouw vastlegt, en is waarschijnlijk geschikt voor het vastleggen van de chromosoomconformatie in combinatie met high-throughput sequencing op specifieke loci (4C-seq) of op genoombrede niveaus (Hi-C).
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie rapporteert een gestandaardiseerde, betrouwbare en eenvoudig uit te voeren methode voor de isolatie en kweek van muissatellietcellen, evenals de beoordeling van transcriptionele regulatie door de CUT&RUN-methode.
Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste is spierverstoring en vezelvertering om een groot aantal verzamelde cellen te garanderen. Ondanks de verhoogde enzymconcentratie werden er meer levende cellen verkregen dan bij gebruik van Protocol 1. Satel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Anastasia Bannwarth voor haar uitstekende technische assistentie. We danken de IGBMC-dierenstalfaciliteit, de celkweek, het Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrijk), de beeldvorming, de elektronenmicroscopie, de flowcytometrie en het GenomEast-platform, lid van het consortium ‘France Génomique’ (ANR-10-INBS-0009).
Dit werk van het Interdisciplinair Thematisch Instituut IMCBio, als onderdeel van het ITI 2021-2028-programma van de Universiteit van Straatsburg, CNRS en Inserm, werd ondersteund door IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) en door het SFRI-STRAT’US-project (ANR 20-SFRI-0012) en EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) in het kader van het Franse Investments for the Future-programma. Aanvullende financiering werd verstrekt door INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisch programma 24376 (aan D.D.), INSERM young researcher grant (aan D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, en een Frans staatsfonds beheerd door de ANR in het kader van het kaderprogramma Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. werd gesteund door het programma CDFA-07-22 van de Université franco-allemande en Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation, en K.G. door de Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
