En presis og kvantifiserbar metode for å samle hemolymfe fra små leddyr

Summary

Vi beskriver en metode for å samle kvantifiserbar hemolymfe effektivt fra små leddyr for senere analyse.

Abstract

Arthropoder er kjent for å overføre en rekke virus av medisinsk og landbruksmessig betydning gjennom deres hemolymfe, noe som er avgjørende for virusoverføring. Hemolymfekolleksjon er den grunnleggende teknologien for å studere virus-vektorinteraksjoner. Her beskriver vi en ny og enkel metode for kvantitativ innsamling av hemolymfe fra små leddyr ved hjelp av Laodelphax striatellus (den lille brune plantehopperen, SBPH) som en forskningsmodell, da denne leddyr er hovedvektoren av risstripevirus (RSV). I denne protokollen begynner prosessen ved å forsiktig klemme av det ene benet på den frosne leddyr med fintippet pinsett og trykke hemolymfen ut av såret. Deretter brukes en enkel mikropipette bestående av en kapillær og en pipettelerkære for å samle transudativ hemolymf fra såret i henhold til prinsippet om kapillærkrefter. Endelig kan den oppsamlede hemolymfen oppløses i en spesifikk buffer for videre studier. Denne nye metoden for å samle hemolymf fra små leddyr er et nyttig og effektivt verktøy for videre forskning på arbovirus og vektorvirusinteraksjoner.

Introduction

Både dyre- og plantevirus kan overføres av leddyr, og disse virusene utgjør en alvorlig trussel mot menneskers helse og forårsaker enorme økonomiske tap i landbruket ^1,2,3. Det er viktig at leddyrhemolymfen, som tjener som sirkulasjonssystemet og et viktig element i immunsystemet i leddyr, spiller en viktig rolle i regulering av arboviral overføring. Virus ervervet gjennom leddyrtarmen transporteres til andre vev først etter vellykket unnslippe det ugunstige hemolymfemiljøet 4,5,6,7. Livssyklusen til virus i leddyrhemolymfen involverer virusoverlevelse i væskeplasmaet, inngang i hemocytten og transport til andre vev, og forskjellige virusvektorinteraksjonsmekanismer forekommer i hemolymfen 8,9,10,11,12. For eksempel er den vertikale overføringen av RSV av SBPH avhengig av en molekylær interaksjon mellom SBPH vitellogeninproteinet og RSV (rice stripe virus) kapsidprotein^13,14. Noen virus kan unnslippe immunresponsen til hemolymfen ved å binde spesifikke vektorfaktorer^15,16,17,18. Derfor er undersøkelse av vektor-virus-interaksjoner i hemolymf av leddyr viktig for å utvikle en bedre forståelse av arbovirusoverføring.

Hemolymfen til noen små insekter, som plantehoppere, bladhopper og noen mygg, er vanskelig å samle på grunn av deres størrelse. For å løse dette problemet har flere metoder blitt utviklet for å samle hemolymfe, inkludert å sette inn en sprøytenål direkte inn i insektlegemet for å trekke ut et mikrovolum av hemolymfen, samle ekssudat fra sårstedet med fintippet pinsett og direkte sentrifugering. Disse metodene har gjort det mulig å måle relative genuttrykksnivåer og virale titere i hemolymfen 19,20,21. Imidlertid er en effektiv metode for å kvantifisere hemolymfevolumet, som er nødvendig for hemocytttelling, proteinkvantifisering og enzymaktivitetsanalyse, foreløpig ikke tilgjengelig for disse små insekter.

SBPH (liten brun plantehopper) er en type liten insektvektor med en kroppslengde på ca. 2-4 mm. SBPH er i stand til å overføre en rekke plantevirus, inkludert RSV, mais grov dvergvirus og ris svart stripet dvergvirus^22,23,24. Samspillet mellom SBPH og RSV har blitt studert i dybden det siste tiåret. For å lette arbeidet med SBPH utviklet vi en ny og enkel metode for å samle hemolymfe. Denne metoden, som er basert på prinsippet om kapillærkrefter, bruker en kapillær med et skalamerke for å skaffe insektets hemolymf på en presis og kvantifiserbar måte. Dette gjør at vi effektivt kan samle et bestemt volum hemolymf fra små insekter og studere hemolymfemiljøet til små vektorer mer detaljert.

Protocol

1. Insekt oppdrett Øk SBPHene som brukes i dette eksperimentet i risplanter (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 risplanter i en inkubator (65 mm x 200 mm), og vokse ved 25 ° C under en 16 t lys / 8 t mørk fotoperiode. 2. Disseksjon av SBPHs for hemolymfeinnsamling Sett SBPH-ene i et sentrifugerør, og legg dem i et isbad i 10-30 minutter.MERK: Ikke plasser SBPHene i isbadet i mindre enn 10 minutter, ellers kan inse…

Representative Results

Mikropipettemodell og hemolymfeoppsamlingVi har utviklet en enkel mikropipette hvis virkning er basert på kapillærkreftene i kapillærrøret. Mikropipetten består av et kapillærrør og en pipettepære (figur 1A). Kapillærrør er tilgjengelige i forskjellige volumstørrelser fra 1 μL til 20 μL, og kapillærrørvolumene velges i henhold til kravene. Kapillærrør med mindre volumer er ikke foreslått fordi de ekstra fine åpninger av mindre volum rør kan gjøre det…

Discussion

Hemolymfe er mediet i sirkulasjonssystemet i leddyr, og arbovirus kan bare invadere andre leddyrvev hvis de er i stand til å overleve det fiendtlige hemolymfemiljøet. Innsamling av en høyverdig prøve av hemolymf er det første trinnet i å studere vektorvirusinteraksjonene som forekommer i hemolymfen. Det har blitt rapportert at insekthemolymfe kan fås fra flere steder på insektets kropp, inkludert et sår på forbenet, et mindre snitt i hodeområdet eller et tåresår i magen^26,27,28,29<sup…

Materials

10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation