Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños
Summary
Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.
Abstract
Se sabe que los artrópodos transmiten una variedad de virus de importancia médica y agrícola a través de su hemolinfa, que es esencial para la transmisión del virus. La recolección de hemolinfa es la tecnología básica para estudiar las interacciones virus-vector. Aquí, describimos un método novedoso y simple para la recolección cuantitativa de hemolinfa de pequeños artrópodos utilizando Laodelphax striatellus (el pequeño saltaplantas marrón, SBPH) como modelo de investigación, ya que este artrópodo es el principal vector del virus de la raya del arroz (VSR). En este protocolo, el proceso comienza pellizcando suavemente una pierna del artrópodo congelado con pinzas de punta fina y presionando la hemolinfa fuera de la herida. Luego, se utiliza una micropipeta simple que consiste en un capilar y un bulbo de pipeta para recoger la hemolinfa transudativa de la herida de acuerdo con el principio de fuerzas capilares. Finalmente, la hemolinfa recolectada se puede disolver en un tampón específico para su posterior estudio. Este nuevo método para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños es una herramienta útil y eficiente para futuras investigaciones sobre arbovirus e interacciones vector-virus.
Introduction
Tanto los virus animales como los vegetales pueden ser transmitidos por artrópodos, y estos virus representan una grave amenaza para la salud humana y causan enormes pérdidas económicas en la agricultura 1,2,3. Es importante destacar que la hemolinfa artrópodo, que sirve como sistema circulatorio y un elemento vital del sistema inmunológico en los artrópodos, juega un papel importante en la regulación de la transmisión arboviral. Los virus adquiridos a través de los intestinos de los artrópodos son transportados a otros tejidos sólo después de escapar con éxito del ambiente hemolinfático adverso 4,5,6,7. El ciclo de vida de los virus en la hemolinfa del artrópodo implica la supervivencia del virus en el plasma fluido, la entrada en el hemocito y el transporte a otros tejidos, y varios mecanismos de interacción virus-vector ocurren en la hemolinfa 8,9,10,11,12. Por ejemplo, la transmisión vertical del VRS por el SBPH depende de una interacción molecular entre la proteína vitelogenina SBPH y la proteína de la cápside13,14 del VSR (virus de la raya de arroz). Algunos virus pueden escapar de la respuesta inmune de la hemolinfa al unirse a factores vectoriales específicos15,16,17,18. Por lo tanto, investigar las interacciones vector-virus en la hemolinfa de los artrópodos es importante para desarrollar una mejor comprensión de la transmisión del arbovirus.
La hemolinfa de algunos insectos pequeños, como saltamontes, saltahojas y algunos mosquitos, es difícil de recolectar debido a su tamaño. Para abordar este problema, se han desarrollado varios métodos para recolectar hemolinfa, incluida la inserción de una aguja de jeringa directamente en el cuerpo del insecto para extraer un microvolumen de la hemolinfa, la recolección de exudado del sitio de la herida con pinzas de punta fina y la centrifugación directa. Estos métodos han permitido la medición de los niveles relativos de expresión génica y títulos virales dentro de la hemolinfa 19,20,21. Sin embargo, actualmente no se dispone de un método eficaz para cuantificar el volumen de hemolinfa, que es necesario para el recuento de hemocitos, la cuantificación de proteínas y el análisis de la actividad enzimática, para estos pequeños insectos.
El SBPH (pequeño saltaplantas marrón) es un tipo de pequeño insecto vector con una longitud corporal de aproximadamente 2-4 mm. El SBPH es capaz de transmitir una variedad de virus de plantas, incluyendo el VSR, el virus enano áspero del maíz y el virus enano rayado negro del arroz22,23,24. La interacción entre el SBPH y el VSR se ha estudiado en profundidad durante la última década. Para facilitar el trabajo con SBPH, desarrollamos un método novedoso y simple de recolección de hemolinfa. Este método, que se basa en el principio de las fuerzas capilares, utiliza un capilar con una marca de escala para adquirir la hemolinfa del insecto de una manera precisa y cuantificable. Esto nos permite recolectar un volumen específico de hemolinfa de pequeños insectos de manera eficiente y estudiar el entorno hemolinfático de pequeños vectores con más detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La hemolinfa es el medio del sistema circulatorio en los artrópodos, y los arbovirus solo pueden invadir otros tejidos de artrópodos si son capaces de sobrevivir al ambiente hostil de la hemolinfa. La recolección de una muestra de hemolinfa de alta calidad es el primer paso para estudiar las interacciones vector-virus que ocurren en la hemolinfa. Se ha informado que la hemolinfa del insecto se puede obtener de varios sitios en el cuerpo del insecto, incluyendo una herida en la pata delantera, una incisión menor en el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2022YFD1401700) y por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32090013 y No. 32072385).
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
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