Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu
Summary
Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.
Abstract
Beyaz, kahverengi ve bej adiposit farklılaşmasının in vitro çalışması, adipositlerin hücre-otonom fonksiyonlarının ve mekanizmalarının araştırılmasını sağlar. Ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre hatları halka açıktır ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dış ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda bej adipositlerin ortaya çıkmasının, halka açık beyaz adiposit hücre hatlarını kullanarak tam olarak özetlenmesi zordur. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu genellikle primer preadipositleri elde etmek ve adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için uygulanır. Bununla birlikte, yağ dokusunun elle kıyılması ve kollajenaz sindirimi deneysel varyasyonlara neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, deneysel çeşitliliği azaltmak, kontaminasyonu azaltmak ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla SVF’nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanan modifiye yarı otomatik bir protokol sunuyoruz. Elde edilen preadipositler ve farklılaşmış adipositler fonksiyonel ve mekanik analizler için kullanılabilir.
Introduction
Yağ dokusu biyolojisi, obezite ve tip 2 diyabet prevalansının küresel olarak artması nedeniyle giderek artan bir ilgi çekmektedir1. Adipositler, fazla enerjiyi, açlıktan sonra salınan lipit damlacıkları şeklinde depolar. Ayrıca, yağ dokusu endokrin bir organ görevi görerek ve diğer dokularla iletişim kurarak sistemik enerji homeostazını korur 2,3. İlginçtir ki, hem aşırı yağ dokusu (obezite) hem de yağ kaybı (lipodistrofi) insülin direnci ve diyabet1 ile bağlantılıdır. Adipositler üç türe ayrılır: beyaz, kahverengi ve bej1. Beyaz adipositler esas olarak fazla enerjiyi lipitler olarak depolarken, kahverengi ve bej adipositler enerjiyi mitokondriyal ayrıştırıcı protein-1 (Ucp1) 1,4 yoluyla ısı şeklinde dağıtırlar. Özellikle, bej adipositler (“indüklenebilir” kahverengi adipositler olarak da adlandırılır), soğuk veya sempatik stimülasyona yanıt olarak beyaz yağ dokusunda ortaya çıkar ve “klasik” kahverengi adipositlerinkilerle örtüşen ancak onlardan farklı olan gen ekspresyon kalıpları sergiler5. Son zamanlarda, kahverengi ve bej adipositlerin, “enerji alımını bastırmak” yerine “enerji dağılımını arttırmayı” amaçlayan anti-obezite ve anti-diyabet tedavilerinin potansiyel hedefleri olarak öngörülmektedir4. Destekleyici olarak, insanlarda FTO obezite varyantı rs1421085’in risk alelinin, yaygın varyantlararasında daha yüksek vücut kitle indeksi (VKİ) ile en güçlü ilişkiyi sergileyen 6,7 ve çeşitli gen-çevreetkileşimleri 8,9, bej adiposit farklılaşmasını ve fonksiyonunu olumsuz yönde düzenlediği bildirilmiştir10. Peroksizom proliferatör-aktive reseptör γ (PPARγ), adipogenezin ana transkripsiyonel düzenleyicisi olarak bilinir ve adiposit farklılaşması için gerekli ve yeterlidir11. 16 (PRDM16), erken b hücre faktörü 2 (EBF2) ve nükleer faktör I-A (NFIA) içeren PRD1-BF1-RIZ1 homolog alan gibi transkripsiyonel düzenleyiciler, kahverengi ve bej adiposit farklılaşması ve fonksiyonu 12,13,14,15,16,17,18 için çok önemlidir. Öte yandan, beyaz adiposit gen programlaması, transdüsin benzeri arttırıcı protein 3 (TLE3) ve çinko parmak proteini 423 (ZFP423) 19,20,21 gibi transkripsiyonel düzenleyiciler gerektirir.
İn vitro model sistemler, adipositlerin fonksiyon ve disfonksiyonlarının altında yatan mekanizma(lar)ın daha iyi anlaşılmasını amaçlayan moleküler çalışmaların yapılmasını sağlar. 3T3-L1 ve 3T3-F442A gibi halka açık ve ölümsüzleştirilmiş preadiposit hücre hatları22,23,24 mevcut olmasına rağmen, primer preadipositlerin kültürü ve adipositlere farklılaşması, in vivo adipogenezi incelemek için daha uygun bir model olacaktır. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu, primer preadipositlerin25,26 elde edilmesinde iyi bilinen bir yöntemdir. Bununla birlikte, genellikle tüp raflı bir bakteriyel çalkalayıcı kullanılarak gerçekleştirilen yağ dokusunun kollajenaz sindirimi, deneysel varyasyona neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir27,28. Burada, SVF’nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için nazik bir manyetik aktive hücre sıralama (MACS) doku ayrıştırıcısı kullanan alternatif bir protokolü açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, preadipositler elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için SVF’nin murin yağ dokusundan izole edilmesi için bir protokol tanımlandı. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısının kullanılması, deneysel çeşitliliği azalttı, kontaminasyon riskini azalttı ve tekrarlanabilirliği arttırdı. Bu prosedür sunulan protokol içinde kritik bir adım olsa da, süreç son derece otomatiktir ve optimizasyona gerek yoktur. Bununla birlikte, fare yaşına ve ya?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, deneysel yardımları için Takahito Wada ve Saiko Yoshida’ya (Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya) teşekkür eder. Bu çalışma YH’ye aşağıdaki hibelerle finanse edilmiştir: Tokyo Üniversitesi Mükemmel Genç Araştırmacı Programı’ndan araştırma hibesi; Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) KAKENHI Erken Kariyer Bilim İnsanları için Yardım Hibesi, hibe numarası 19K17976; Japonya Uygulamalı Enzimoloji Vakfı’ndan Gelecekteki Diyabet Araştırmalarının Ön Koşucusu (FFDR) için hibe, hibe numarası 17F005; Farmakolojik Araştırma Vakfı’ndan hibe; Mochida Memorial Tıbbi ve Farmasötik Araştırma Vakfı’ndan hibe; MSD Yaşam Bilimleri Vakfı’ndan hibe; Daiwa Menkul Kıymetler Sağlık Vakfı’ndan hibe; Tokyo Biyokimyasal Araştırma Vakfı’ndan hibe; Takeda Bilim Vakfı’ndan Yaşam Bilimleri Araştırma bursu; ve SENSHIN Tıbbi Araştırma Vakfı’ndan hibe.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
