Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire
Summary
Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.
Abstract
L’étude in vitro de la différenciation des adipocytes blancs, bruns et beiges permet d’étudier les fonctions autonomes cellulaires des adipocytes et leurs mécanismes. Les lignées cellulaires de préadipocytes blancs immortalisés sont accessibles au public et largement utilisées. Cependant, l’émergence d’adipocytes beiges dans le tissu adipeux blanc en réponse à des signaux externes est difficile à récapituler dans son intégralité en utilisant des lignées cellulaires adipocytaires blanches accessibles au public. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est couramment exécuté pour obtenir des préadipocytes primaires et effectuer la différenciation des adipocytes. Cependant, le hachage et la digestion de la collagénase du tissu adipeux à la main peuvent entraîner des variations expérimentales et sont sujets à la contamination. Ici, nous présentons un protocole semi-automatisé modifié qui utilise un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase afin d’isoler plus facilement la SVF, dans le but de réduire la variation expérimentale, de réduire la contamination et d’augmenter la reproductibilité. Les préadipocytes obtenus et les adipocytes différenciés peuvent être utilisés pour des analyses fonctionnelles et mécanistes.
Introduction
La biologie du tissu adipeux attire de plus en plus l’attention en raison de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète de type 2 dans le monde1. Les adipocytes stockent l’excès d’énergie sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont libérées en cas de famine. De plus, le tissu adipeux maintient l’homéostasie énergétique systémique en servant d’organe endocrinien et en communiquant avec d’autres tissus 2,3. Curieusement, l’excès de tissu adipeux (obésité) et la perte adipeuse (lipodystrophie) sont liés à la résistance à l’insuline et au diabète1. Les adipocytes sont divisés en trois types: blanc, brun et beige1. Les adipocytes blancs stockent principalement l’excès d’énergie sous forme de lipides, tandis que les adipocytes bruns et beiges dissipent l’énergie sous forme de chaleur via la protéine de découplage mitochondrial-1 (Ucp1)1,4. Notamment, les adipocytes beiges (aussi appelés adipocytes bruns « inductibles ») apparaissent dans le tissu adipeux blanc en réponse à une stimulation froide ou sympathique et présentent des schémas d’expression génique qui se chevauchent avec ceux des adipocytes bruns « classiques» 5 mais qui sont distincts de ceux-ci. Récemment, les adipocytes bruns et beiges ont été anticipés comme cibles potentielles des traitements anti-obésité et anti-diabète visant à « améliorer la dissipation énergétique » plutôt qu’à « supprimer l’apport énergétique »4. À l’appui, l’allèle de risque de la variante d’obésité FTO rs1421085 chez l’homme, qui présente la plus forte association avec un indice de masse corporelle (IMC) plus élevé parmi les variantes courantes 6,7 et présente diverses interactions gène-environnement8,9, régulerait négativement la différenciation et la fonction des adipocytes beiges10. Le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ (PPARγ) est connu comme un régulateur transcriptionnel maître de l’adipogenèse et est nécessaire et suffisant pour la différenciation des adipocytes11. Les régulateurs transcriptionnels, tels que le domaine homologue PRD1-BF1-RIZ1 contenant 16 (PRDM16), le facteur 2 précoce des cellules b (EBF2) et le facteur nucléaire I-A (NFIA), sont cruciaux pour la différenciation et la fonction des adipocytes bruns et beiges 12,13,14,15,16,17,18 . D’autre part, la programmation du gène adipocytaire blanc nécessite des régulateurs transcriptionnels, tels que la protéine 3 amplificateur de type transducine (TLE3) et la protéine 423 (ZFP423)19,20,21.
Les systèmes modèles in vitro permettent de réaliser des études moléculaires visant à améliorer la compréhension du ou des mécanismes sous-jacents aux fonctions et aux dysfonctionnements des adipocytes. Bien qu’il existe des lignées cellulaires de préadipocytes accessibles au public et immortalisées telles que 3T3-L1 et 3T3-F442A22,23,24, la culture de préadipocytes primaires et la différenciation en adipocytes seraient un modèle plus approprié pour étudier l’adipogenèse in vivo. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est une méthode bien connue pour obtenir des préadipocytes primaires25,26. Cependant, la digestion de la collagénase du tissu adipeux, qui est généralement effectuée à l’aide d’un agitateur bactérien avec une grille à tubes, peut entraîner des variations expérimentales et est sujette à la contamination27,28. Ici, nous décrivons un protocole alternatif qui utilise un dissociateur de tissu doux de tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour la digestion de la collagénase afin d’obtenir une isolation plus facile de la SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole d’isolement de la SVF à partir du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et effectuer une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase a diminué la variation expérimentale, diminué le risque de contamination et augmenté la reproductibilité. Bien que cette procédure soit une étape critique du protocole présenté, le processus est hautement automatisé et l’optimisation n’…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Takahito Wada et Saiko Yoshida (Université de Tokyo, Tokyo, Japon) pour leur aide expérimentale. Ce travail a été financé par les subventions suivantes à Y.H.: subvention de recherche du programme Excellent Young Researcher de l’Université de Tokyo; Subvention KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) pour les scientifiques en début de carrière, numéro de subvention 19K17976; subvention pour le Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fondation japonaise pour l’enzymologie appliquée, numéro de subvention 17F005; subvention de la Pharmacological Research Foundation; subvention de la Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subvention de la Fondation MSD pour les sciences de la vie; subvention de la Daiwa Securities Health Foundation; subvention de la Tokyo Biochemical Research Foundation; Subvention de recherche en sciences de la vie de la Takeda Science Foundation; et subvention de la Fondation pour la recherche médicale SSENSHIN.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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