Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Summary

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Abstract

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

Introduction

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme ^1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer³. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles à^traiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7^, a été lié aux mécanismes de la maladie sous-jacents PC⁸. Les mitochondries sont également très dynamiques, ce qui se reflète dans les changements fréquents et dynamiques de leur connectivité réseau et de leur structure^{critique 9}. Le remodelage de la structure des cristae peut avoir un impact direct sur la fonction mitochondriale et l’état cellulaire 10,11, qui sont considérablement modifiés au cours de la croissance des cellules tumorales, des métastases et des changements du microenvironnement tumoral ^12,13.

Ces dernières années, les scientifiques ont étudié cet organite en utilisant l’observation EM^14,15,16,17; par exemple, les chercheurs ont analysé la dynamique mitochondriale à l’aide de techniques de reconstruction 3D 6,7,18,19. Le concept général et la méthode de reconstruction 3D d’images de microscopie électronique ont été formellement établis dès 1968²⁰ et impliquaient la combinaison de la microscopie électronique, de la diffraction électronique et du traitement d’images par ordinateur pour reconstruire la queue du phage T4. Jusqu’à présent, la technologie d’imagerie 3D par microscopie électronique a fait des progrès significatifs en termes de résolution d’image²¹, de degré d’automatisation 22 et de volume de traitement 23 et a été utilisée à une échelle de plus en plus large dans la recherche biologique, du niveau tissulaire à l’ultrastructure des organites à l’échelle nanométrique²⁴. Ces dernières années, l’imagerie 3D par microscopie électronique est également devenue une technologie prometteuse pour un large éventail d’applications^25,26,27.

L’attention croissante portée aux cristae mitochondriales illustre particulièrement les exigences essentielles de l’imagerie ultrastructurale du volume. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour visualiser des échantillons prélevés sur une grille de cuivre (400 mesh)²⁸, le faisceau d’électrons traversant la section. Cependant, en raison de la portée limitée de la grille de cuivre, il est impossible d’imager complètement des tranches continues du même échantillon²⁹. Cela complique l’étude des structures cibles lors de l’imagerie TEM. De plus, la GDT repose sur des tâches manuelles longues et sujettes aux erreurs, y compris la découpe et la collecte de plusieurs tranches et leur imagerie séquentielle²¹, de sorte qu’elle n’est pas adaptée aux reconstructions ultrastructurales d’échantillons de grand volume²³. À l’heure actuelle, la reconstruction à haute résolution d’échantillons d’échantillons de grand volume est réalisée grâce à l’utilisation d’équipement spécialisé, comme le réseau de caméras TEM (TEMCA)³⁰ ou deux systèmes TEMCA de deuxième génération (TEMCA2)³¹, qui permettent d’obtenir rapidement des images automatisées à haut débit. Cependant, ce type d’imagerie n’a pas l’avantage d’être facile à obtenir et universel en raison de la nécessité d’un équipement personnalisé.

Par rapport à la TEM, la méthode de génération automatique de milliers d’images volumétriques série pour de grandes surfaces basée sur SEM^32,33 améliore l’efficacité et la fiabilité de l’imagerie série et offre des résolutions z³⁴ plus élevées. Par exemple, la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont toutes deux permis de réaliser la reconstruction 3D de l’ultrastructure avec une vitesse, une efficacité et une résolution élevées^35,36. Cependant, il est inévitable que la surface du bloc soit rasée mécaniquement par le couteau diamanté du SBF-SEM ou par fraisage avec le faisceau d’ions focalisé de FIB-SEM^33,37. En raison du caractère destructeur des deux méthodes pour les échantillons, il n’est pas possible de reconstruire la même structure cible pour une analyse plus approfondie^38,39,40. De plus, peu d’études ont tenté de reconstruire l’ultrastructure 3D des organites des cellules cancéreuses en utilisant EM pour observer des changements pathologiques¹². Pour ces raisons, afin d’élucider davantage les mécanismes pathologiques des cellules cancéreuses, telles que les cellules cancéreuses du pancréas, nous proposons une nouvelle technologie pour la reconstruction 3D d’images de coupe en série à l’aide d’un ultramicrotome et d’un microscope électronique à balayage par émission de champ (FE-SEM) pour analyser l’ultrastructure mitochondriale au niveau des crêtes; Grâce à cette technologie, des données haute résolution peuvent être acquises à l’aide d’une méthode efficace et accessible. Les sections ultraminces en série réalisées à l’aide d’un ultramicrotome peuvent être stockées de manière semi-permanente dans un boîtier de grille et réimagées plusieurs fois, même après plusieurs années⁴¹. FE-SEM est un outil très apprécié dans divers domaines de recherche en raison de sa capacité à fournir une imagerie haute résolution, un grossissement élevé et une polyvalence⁴². Dans une tentative d’afficher la structure fine des organites en 3D, la technique de production d’empilements d’images 2D en série avec une résolution utile en utilisant des électrons rétrodiffusés produits par FE-SEM ^43,44 peut également être utilisée pour obtenir une imagerie à haut débit et multi-échelle des régions cibles ou de leurs structures associées sans équipement spécial ⁴⁵. La génération d’artefacts de charge affecte directement la qualité des images acquises, il est donc particulièrement important de garder le temps de séjour court.

Ainsi, la présente étude développe les procédures expérimentales employées dans cette technique SEM pour reconstruire la structure 3D des cristae mitochondriales⁴⁶. Plus précisément, nous montrons le processus développé pour réaliser la segmentation semi-automatique des régions mitochondriales et numériser la reconstruction 3D à l’aide du logiciel Amira, ce qui implique également de faire des échantillons de tranches en utilisant la méthode conventionnelle de préparation des échantillons OTO^44,47, de compléter la collection de sections en utilisant le découpage ultramicrotome et d’acquérir des données 2D séquentielles par FE-SEM.

Protocol

1. Préparation du matériel Culture de 2 x 106 cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h. Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 107 c…

Representative Results

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 …

Discussion

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2