JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Recherche en cancérologie

En tredimensionel teknik til visualisering af mitokondrie ultrastrukturelle ændringer i kræftceller i bugspytkirtlen

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65290
, , , , , ,
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man rekonstruerer mitokondriecristae for at opnå 3D-billeddannelse med høj nøjagtighed, høj opløsning og højt gennemløb.

Abstract

Forståelse af de dynamiske træk ved celleorganellens ultrastruktur, som ikke kun er rig på ukendt information, men også sofistikeret fra et tredimensionelt (3D) perspektiv, er afgørende for mekanistiske studier. Elektronmikroskopi (EM) giver god billeddybde og giver mulighed for rekonstruktion af billedstakke i høj opløsning for at undersøge den ultrastrukturelle morfologi af cellulære organeller selv på nanometerskala; derfor får 3D-rekonstruktion betydning på grund af dens uforlignelige fordele. Scanning elektronmikroskopi (SEM) giver en high-throughput billedoptagelsesteknologi, der gør det muligt at rekonstruere store strukturer i 3D fra det samme område af interesse i på hinanden følgende skiver. Derfor bliver anvendelsen af SEM i storstilet 3D-rekonstruktion for at genoprette den ægte 3D-ultrastruktur af organeller stadig mere almindelig. I denne protokol foreslår vi en kombination af seriel ultratynd sektion og 3D-rekonstruktionsteknikker til at studere mitokondrie-cristae i kræftceller i bugspytkirtlen. Detaljerne om, hvordan disse teknikker udføres, beskrives i denne protokol trin for trin, herunder osmium-thiocarbohydrazid-osmium (OTO) -metoden, den serielle ultratynde sektionsbilleddannelse og visualiseringsdisplayet.

Introduction

Mitokondrier er en af de vigtigste organeller i cellen. De tjener som det centrale knudepunkt for cellulær bioenergetik og metabolisme 1,2 og spiller en kritisk rolle i kræft3. Kræft i bugspytkirtlen (PC) er en af de sværeste kræftformer4 at behandle på grund af dens hurtige spredning og høje dødelighed. Mitokondriel dysfunktion, som hovedsageligt skyldes ændringer i mitokondriemorfologien 3,5,6,7, har været forbundet med sygdomsmekanismerne bag PC8. Mitokondrier er også meget dynamiske, hvilket afspejles af de hyppige og dynamiske ændringer i deres netværksforbindelse og cristae-struktur9. Omformningen af cristaestrukturen kan direkte påvirke mitokondriefunktionen og cellulær tilstand10,11, som ændres signifikant under tumorcellevækst, metastase og tumormikromiljøændringer12,13.

I de senere år har forskere studeret denne organel ved hjælp af EM-observation14,15,16,17; for eksempel har forskere analyseret mitokondriedynamikken ved hjælp af 3D-rekonstruktionsteknikker 6,7,18,19. Det generelle koncept og metode til 3D-rekonstruktion af elektronmikroskopibilleder blev formelt etableret allerede i 196820 og involverede kombination af elektronmikroskopi, elektrondiffraktion og computerbilledbehandling for at rekonstruere T4-faghalen. Indtil nu har elektronmikroskopi 3D-billeddannelsesteknologi gjort betydelige fremskridt med hensyn til billedopløsning 21, automatiseringsgrad 22 og behandlingsvolumen23 og er blevet brugt i stadig bredere skala inden for biologisk forskning, fra vævsniveau til organel ultrastrukturniveau på nanometerskala24. I de senere år er elektronmikroskopi 3D-billeddannelse også blevet en lovende teknologi til en bred vifte af applikationer25,26,27.

Den voksende opmærksomhed på mitokondrie-cristae illustrerer især de væsentlige krav til ultrastrukturel volumenbilleddannelse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er blevet brugt til at visualisere prøver indsamlet på et kobbergitter (400 mesh)28, hvor elektronstrålen passerer gennem sektionen. På grund af kobbergitterets begrænsede rækkevidde er det imidlertid umuligt fuldt ud at afbilde kontinuerlige skiver af den samme prøve29. Dette komplicerer undersøgelsen af målstrukturer under TEM-billeddannelse. Derudover er TEM afhængig af tidskrævende og fejlbehæftede manuelle opgaver, herunder skæring og indsamling af flere skiver og billeddannelse af dem sekventielt21, så det er ikke tilpasset til ultrastrukturelle rekonstruktioner af prøver i store mængder23. På nuværende tidspunkt opnås rekonstruktion i høj opløsning af prøvebilleddannelse i store mængder ved brug af specialudstyr, såsom TEM-kameraarrayet (TEMCA)30 eller to andengenerations-TEMCA-systemer (TEMCA2)31, som muliggør automatiseret billeddannelse med høj kapacitet på kort tid. Denne type billeddannelse har imidlertid ikke fordelen ved at være let at opnå og universel på grund af kravet om tilpasset udstyr.

Sammenlignet med TEM forbedrer metoden til automatisk generering af tusindvis af serielle volumetriske billeder til store områder baseret på SEM 32,33 effektiviteten og pålideligheden af seriel billeddannelse og leverer højere z-opløsninger34. For eksempel har seriel blokfladescanningelektronmikroskopi (SBF-SEM) og fokuseret ionstrålescanningelektronmikroskopi (FIB-SEM) begge gjort det muligt at opnå 3D-rekonstruktion af ultrastruktur med høj hastighed, effektivitet og opløsning35,36. Det er imidlertid uundgåeligt, at blokoverfladen barberes mekanisk af SBF-SEM’s diamantkniv eller ved fræsning med den fokuserede ionstråle i FIB-SEM33,37. På grund af de to metoders destruktivitet over for prøverne er det ikke muligt at rekonstruere den samme målstruktur igen til yderligere analyse38,39,40. Derudover har få undersøgelser forsøgt at rekonstruere 3D-organelultrastrukturen af kræftceller ved hjælp af EM for at observere patologiske ændringer12. Af disse grunde foreslår vi for yderligere at belyse de patologiske mekanismer i kræftceller, såsom kræftceller i bugspytkirtlen, en ny teknologi til 3D-rekonstruktion af serielle sektionsbilleder ved hjælp af et ultramikrotomt og et feltemissionsscanningelektronmikroskop (FE-SEM) til at analysere mitokondrie-ultrastrukturen på cristae-niveau; Med denne teknologi kan data i høj opløsning erhverves ved hjælp af en effektiv og tilgængelig metode. De serielle ultratynde sektioner lavet ved hjælp af et ultramikrotomt kan gemmes semi-permanent i et gitterhus og genafbildes flere gange, selv efter flere år41. FE-SEM er højt værdsat som et værktøj inden for forskellige forskningsområder på grund af dets evne til at levere billeddannelse i høj opløsning, høj forstørrelse og alsidighed42. I et forsøg på at vise organellernes fine struktur i 3D kan teknikken til fremstilling af serielle 2D-billedstakke med nyttig opløsning ved hjælp af tilbagespredte elektroner produceret af FE-SEM 43,44 også bruges til at opnå billeddannelse med høj gennemstrømning og multiskala af målregioner eller deres tilknyttede strukturer uden specielt udstyr 45. Genereringen af ladningsartefakter påvirker direkte kvaliteten af de erhvervede billeder, så det er især vigtigt at holde opholdstiden kort.

Således uddyber denne undersøgelse de eksperimentelle procedurer, der anvendes i denne SEM-teknik til at rekonstruere 3D-strukturen af mitokondrie-cristae46. Specifikt viser vi processen udviklet til at opnå den halvautomatiske segmentering af mitokondrieregioner og digitalisere 3D-rekonstruktionen ved hjælp af Amira-software, som også involverer fremstilling af skiveprøver ved hjælp af den konventionelle OTO-prøveforberedelsesmetode44,47, færdiggørelse af sektionssamlingen ved hjælp af ultramicrotomskæring og erhvervelse af sekventielle 2D-data af FE-SEM.

Protocol

1. Materiale forberedelse Dyrkning 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10% føtalt bovint serum og 100 E / ml penicillin-streptomycin) og opretholdes ved 37 ° C og 95% fugtighed i en atmosfære på 5% kuldioxid og 95% luft i 48 timer. Panc02-celler opsamles, centrifugeres ved 28 x g i 2 min., og supernatanten kasseres derefter. Sørg for, at prøven har en passende størrelse (1 x 107 celler), da ellers fungerer følgende fikserings- og dehydreri…

Representative Results

Under cellekultur (figur 1A) opdelte vi først kræftcellerne i bugspytkirtlen i en kontrolgruppe dyrket med komplet dyrkningsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptoseaktivator, 100 nM) gruppe og en RSL3 (100 nM) plus ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptosehæmmer, 100 nM) gruppe. Gennem ovenstående eksperimentelle trin erhvervede scanningelektronmikroskopet 38 (supplerende figur 1), 43 (supplerende figur 2) og 44 (supplerende figur…

Discussion

Metoden, der præsenteres her, er en nyttig trinvis vejledning til anvendelse af 3D-rekonstruktionsteknikken, som indebærer anvendelse af elektronmikroskopi og billedbehandlingsteknologi til stabling og segmentering af 2D-tomografiske billeder genereret fra serielle ultratynde sektioner. Denne protokol fremhæver en begrænsning af 2D-billeder, der kan løses ved 3D-visualisering af organellens ultrastruktur, som har fordelene ved stærk reproducerbarhed af strukturerne på et højopløsningsniveau og højere nøjagtigh…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af Natural Science Foundation of Zhejiang Province tilskud (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China tilskud (82274364, 81673607 og 81774011); samt det offentlige velfærdsforskningsprojekt fra Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Vi sætter pris på den store hjælp, teknisk support og eksperimentel support fra Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.

Materials

(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929 2020.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux’ Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited – New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer’s disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).

Tags

3D ReconstructionElectron MicroscopyUltrastructureMitochondriaPancreatic CancerOrganelle MorphologyOTO MethodSerial SectioningVisualization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image