Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Summary

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Abstract

Het begrijpen van de dynamische kenmerken van de ultrastructuur van het celorganel, die niet alleen rijk is aan onbekende informatie, maar ook geavanceerd vanuit een driedimensionaal (3D) perspectief, is van cruciaal belang voor mechanistische studies. Elektronenmicroscopie (EM) biedt een goede beelddiepte en maakt de reconstructie van beeldstapels met hoge resolutie mogelijk om de ultrastructurele morfologie van cellulaire organellen te onderzoeken, zelfs op nanometerschaal; daarom wint 3D-reconstructie aan belang vanwege de onvergelijkbare voordelen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt een high-throughput beeldacquisitietechnologie die het mogelijk maakt om grote structuren in 3D te reconstrueren vanuit hetzelfde interessegebied in opeenvolgende segmenten. Daarom wordt de toepassing van SEM in grootschalige 3D-reconstructie om de echte 3D-ultrastructuur van organellen te herstellen steeds gebruikelijker. In dit protocol stellen we een combinatie van seriële ultradunne sectie en 3D-reconstructietechnieken voor om mitochondriale cristae in pancreaskankercellen te bestuderen. De details van hoe deze technieken worden uitgevoerd, worden in dit protocol stapsgewijs beschreven, inclusief de osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) -methode, de seriële ultradunne sectiebeeldvorming en de visualisatieweergave.

Introduction

Mitochondriën zijn een van de belangrijkste organellen in de cel. Ze dienen als de centrale hub van cellulaire bio-energetica en metabolisme ^1,2 en spelen een cruciale rol bij kanker³. Alvleesklierkanker (PC) is een van de moeilijkste kankers⁴ om te behandelen vanwege de snelle verspreiding en het hoge sterftecijfer. Mitochondriale disfunctie, die voornamelijk wordt veroorzaakt door veranderingen in de mitochondriale morfologie 3,5,6,7^, is in verband gebracht met de ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan PC⁸. Mitochondriën zijn ook zeer dynamisch, wat wordt weerspiegeld door de frequente en dynamische veranderingen in hun netwerkconnectiviteit en cristae-structuur⁹. De hervorm van de cristae-structuur kan rechtstreeks van invloed zijn op de mitochondriale functie en cellulaire toestand 10,11, die aanzienlijk worden veranderd tijdens tumorcelgroei, metastase en tumormicro-omgevingsveranderingen ^12,13.

In de afgelopen jaren hebben wetenschappers dit organel bestudeerd met behulp van EM-observatie^14,15,16,17; onderzoekers hebben bijvoorbeeld de mitochondriale dynamiek geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructietechnieken 6,7,18,19. Het algemene concept en de methode voor de 3D-reconstructie van elektronenmicroscopiebeelden werden al in 1968 formeel vastgesteld²⁰ en omvatten het combineren van elektronenmicroscopie, elektronendiffractie en computerbeeldverwerking om de T4-faagstaart te reconstrueren. Tot nu toe heeft de 3D-beeldvormingstechnologie voor elektronenmicroscopie aanzienlijke vooruitgang geboekt in termen van beeldresolutie 21, mate van automatisering 22 en verwerkingsvolume²³ en is het op steeds grotere schaal gebruikt in biologisch onderzoek, van weefselniveau tot organel ultrastructuurniveau op nanometerschaal²⁴. In de afgelopen jaren is elektronenmicroscopie 3D-beeldvorming ook een veelbelovende technologie geworden voor een breed scala aan toepassingen^25,26,27.

De groeiende aandacht voor mitochondriale cristae illustreert vooral de essentiële vereisten voor ultrastructurele volumebeeldvorming. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is gebruikt om monsters te visualiseren die zijn verzameld op een koperen rooster (400 mesh)²⁸, waarbij de elektronenbundel door de sectie gaat. Vanwege het beperkte bereik van het koperen rooster is het echter onmogelijk om continue segmenten van hetzelfde monster volledig in beeld te brengen²⁹. Dit bemoeilijkt de studie van doelstructuren tijdens TEM-beeldvorming. Bovendien vertrouwt TEM op tijdrovende en foutgevoelige handmatige taken, waaronder het snijden en verzamelen van meerdere plakjes en deze sequentieel in beeld brengen²¹, zodat het niet is aangepast voor ultrastructurele reconstructies van monsters met een groot volume²³. Op dit moment wordt de reconstructie met hoge resolutie van grootvolume-beeldvorming bereikt door het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, zoals de TEM-camera-array (TEMCA)³⁰ of twee TEMCA-systemen van de tweede generatie (TEMCA2)³¹, die geautomatiseerde high-throughput imaging in korte tijd mogelijk maken. Dit type beeldvorming heeft echter niet het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en universeel is vanwege de vereiste voor aangepaste apparatuur.

In vergelijking met TEM verbetert de methode voor het automatisch genereren van duizenden seriële volumetrische beelden voor grote gebieden op basis van SEM ^32,33 de efficiëntie en betrouwbaarheid van seriële beeldvorming en levert hogere z-resoluties³⁴. Bijvoorbeeld, seriële block-face scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) en gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) hebben het beide mogelijk gemaakt om de 3D-reconstructie van ultrastructuur te bereiken met hoge snelheid, efficiëntie en resolutie^35,36. Het is echter onvermijdelijk dat het blokoppervlak mechanisch wordt afgeschoren door het diamantmes van de SBF-SEM of door te frezen met de gefocusseerde ionenbundel van FIB-SEM^33,37. Vanwege de destructiviteit van de twee methoden voor de monsters, is het niet mogelijk om dezelfde doelstructuur opnieuw te reconstrueren voor verdere analyse^38,39,40. Bovendien hebben weinig studies geprobeerd om de 3D-organel-ultrastructuur van kankercellen te reconstrueren met behulp van EM om pathologische veranderingen te observeren¹². Om deze redenen, om de pathologische mechanismen van kankercellen, zoals alvleesklierkankercellen, verder op te helderen, stellen we een nieuwe technologie voor voor de 3D-reconstructie van seriële sectiebeelden met behulp van een ultramicrotoom en een veldemissiescanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) om de mitochondriale ultrastructuur op cristae-niveau te analyseren; Met deze technologie kunnen gegevens met een hoge resolutie worden verkregen met behulp van een efficiënte en toegankelijke methode. De seriële ultradunne secties gemaakt met behulp van een ultramicrotoom kunnen semi-permanent worden opgeslagen in een rasterbehuizing en meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, zelfs na enkele jaren⁴¹. FE-SEM wordt zeer gewaardeerd als een hulpmiddel in verschillende onderzoeksgebieden vanwege het vermogen om beeldvorming met hoge resolutie, hoge vergroting en veelzijdigheid te bieden⁴². In een poging om de fijne structuur van organellen in 3D weer te geven, kan de techniek voor het produceren van seriële 2D-beeldstapels met nuttige resolutie met behulp van terugverstrooide elektronen geproduceerd door FE-SEM ^43,44 ook worden gebruikt om hoge doorvoer en multi-scale beeldvorming van doelgebieden of hun bijbehorende structuren te bereiken zonder speciale apparatuur ⁴⁵. Het genereren van ladingartefacten heeft direct invloed op de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen, dus het is vooral belangrijk om de verblijftijd kort te houden.

De huidige studie gaat dus dieper in op de experimentele procedures die in deze SEM-techniek worden gebruikt om de 3D-structuur van mitochondriale cristae⁴⁶ te reconstrueren. In het bijzonder tonen we het proces dat is ontwikkeld om de semi-automatische segmentatie van mitochondriale regio’s te bereiken en de 3D-reconstructie te digitaliseren met behulp van Amira-software, waarbij ook slice-monsters worden gemaakt met behulp van de conventionele OTO-monstervoorbereidingsmethode^44,47, de sectieverzameling wordt voltooid met behulp van ultramicrotoomsegmentering en sequentiële 2D-gegevens worden verkregen door FE-SEM.

Protocol

1. Materiaalvoorbereiding Kweek 2 x 106 Panc02-cellen in 12 ml DMEM-medium (10% foetaal runderserum en 100 U / ml penicilline-streptomycine) en houd gedurende 48 uur op 37 °C en 95% vochtigheid in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 95% lucht. Verzamel Panc02-cellen, centrifugeer gedurende 2 minuten op 28 x g en gooi het supernatant vervolgens weg. Zorg ervoor dat het monster de juiste grootte heeft (1 x 107 cellen), omdat anders de volgende fixatie…

Representative Results

Tijdens de celkweek (figuur 1A) verdeelden we de alvleesklierkankercellen eerst in een controlegroep gekweekt met volledig kweekmedium, een (1S,3R)-RSL348 (RSL3, een ferroptose-activator, 100 nM) groep, en een RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, een ferroptoseremmer, 100 nM) groep. Door de bovenstaande experimentele stappen verkreeg de scanning elektronenmicroscoop 38 (aanvullende figuur 1), 43 (aanvullende figuur 2) en 44 (aanv…

Discussion

De hier gepresenteerde methode is een nuttige stapsgewijze handleiding voor het toepassen van de 3D-reconstructietechniek, waarbij elektronenmicroscopie en beeldverwerkingstechnologie worden toegepast op het stapelen en segmenteren van 2D-tomografische beelden die zijn gegenereerd uit seriële ultradunne secties. Dit protocol benadrukt een beperking van 2D-beelden die kunnen worden aangepakt door 3D-visualisatie van de organel-ultrastructuur, wat de voordelen heeft van een sterke reproduceerbaarheid van de structuren op …

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2