Eine dreidimensionale Technik zur Visualisierung mitochondrialer ultrastruktureller Veränderungen in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondriale Cristae rekonstruiert werden, um eine 3D-Bildgebung mit hoher Genauigkeit, hoher Auflösung und hohem Durchsatz zu erreichen.

Abstract

Das Verständnis der dynamischen Eigenschaften der Ultrastruktur der Zellorganellen, die nicht nur reich an unbekannten Informationen ist, sondern auch aus einer dreidimensionalen (3D) Perspektive anspruchsvoll ist, ist für mechanistische Studien von entscheidender Bedeutung. Die Elektronenmikroskopie (EM) bietet eine gute Abbildungstiefe und ermöglicht die Rekonstruktion hochauflösender Bildstapel, um die ultrastrukturelle Morphologie von Zellorganellen auch auf der Nanometerskala zu untersuchen. daher gewinnt die 3D-Rekonstruktion aufgrund ihrer unvergleichlichen Vorteile an Bedeutung. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) bietet eine Hochdurchsatz-Bilderfassungstechnologie, die es ermöglicht, große Strukturen in 3D aus demselben interessierenden Bereich in aufeinanderfolgenden Schichten zu rekonstruieren. Daher wird die Anwendung von REM in der großflächigen 3D-Rekonstruktion zur Wiederherstellung der echten 3D-Ultrastruktur von Organellen immer häufiger. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination aus seriellen Ultradünnschnitt- und 3D-Rekonstruktionstechniken vor, um mitochondriale Cristae in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu untersuchen. Die Details, wie diese Techniken durchgeführt werden, werden in diesem Protokoll Schritt für Schritt beschrieben, einschließlich der Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium (OTO)-Methode, der seriellen Ultradünnschnitt-Bildgebung und der Visualisierungsanzeige.

Introduction

Mitochondrien sind eines der wichtigsten Organellen in der Zelle. Sie dienen als zentraler Knotenpunkt der zellulären Bioenergetik und des Stoffwechsels ^1,2 und spielen eine entscheidende Rolle bei Krebs³. Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC) ist aufgrund seiner schnellen Ausbreitung und hohen Sterblichkeitsrate eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten⁴. Die mitochondriale Dysfunktion, die hauptsächlich durch Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie verursacht wird 3,5,6,7, wurde mit den Krankheitsmechanismen in Verbindung gebracht^, die PC⁸ zugrunde liegen. Mitochondrien sind auch sehr dynamisch, was sich in den häufigen und dynamischen Veränderungen ihrer Netzwerkkonnektivität und Kristallstruktur widerspiegelt⁹. Die Umformung der Cristae-Struktur kann sich direkt auf die mitochondriale Funktion und den Zellzustand auswirken 10,11, die während des Wachstums von Tumorzellen, der Metastasierung und der Veränderungen der Tumormikroumgebung signifikant verändert werden ^12,13.

In den letzten Jahren haben Wissenschaftler dieses Organell mit Hilfe der EM-Beobachtung ^14,15,16,17 untersucht; Zum Beispiel haben Forscher die mitochondriale Dynamik mit Hilfe von 3D-Rekonstruktionstechniken analysiert 6,7,18,19. Das allgemeine Konzept und die Methode für die 3D-Rekonstruktion von elektronenmikroskopischen Bildern wurden bereits 1968²⁰ formell festgelegt und beinhalteten die Kombination von Elektronenmikroskopie, Elektronenbeugung und Computerbildverarbeitung zur Rekonstruktion des T4-Phagenschwanzes. Bisher hat die elektronenmikroskopische 3D-Bildgebungstechnologie erhebliche Fortschritte in Bezug auf die Bildauflösung²¹, den Automatisierungsgrad 22 und das Verarbeitungsvolumen 23 gemacht und wird in der biologischen Forschung in immer breiterem Maßstab eingesetzt, von der Gewebeebene bis zur Organellen-Ultrastrukturebene auf der Nanometerskala²⁴. In den letzten Jahren hat sich auch die elektronenmikroskopische 3D-Bildgebung zu einer vielversprechenden Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt^25,26,27.

Die wachsende Aufmerksamkeit für mitochondriale Cristae verdeutlicht insbesondere die wesentlichen Anforderungen an die ultrastrukturelle Volumenbildgebung. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um Proben zu visualisieren, die auf einem Kupfergitter (400 Mesh)²⁸ gesammelt wurden, wobei der Elektronenstrahl durch den Abschnitt verläuft. Aufgrund des begrenzten Bereichs des Kupfergitters ist es jedoch unmöglich, kontinuierliche Schichten derselben Probe²⁹ vollständig abzubilden. Dies erschwert die Untersuchung von Zielstrukturen während der TEM-Bildgebung. Darüber hinaus stützt sich die TEM auf zeitaufwändige und fehleranfällige manuelle Aufgaben, einschließlich des Schneidens und Sammelns mehrerer Schichten und deren sequentieller Abbildung²¹, so dass sie nicht für ultrastrukturelle Rekonstruktionen großvolumiger Proben geeignet ist²³. Gegenwärtig wird die hochauflösende Rekonstruktion von großvolumigen Probenbildern durch den Einsatz von Spezialgeräten wie dem TEM-Kameraarray (TEMCA)³⁰ oder zwei TEMCA-Systemen der zweiten Generation (TEMCA2)³¹ erreicht, die eine automatisierte Hochdurchsatz-Bildgebung in kurzer Zeit ermöglichen. Diese Art der Bildgebung hat jedoch nicht den Vorteil, dass sie leicht zu erhalten und universell ist, da eine maßgeschneiderte Ausrüstung erforderlich ist.

Im Vergleich zur TEM verbessert das Verfahren zur automatischen Erzeugung von Tausenden von seriellen volumetrischen Bildern für große Flächen auf der Grundlage von REM ^32,33 die Effizienz und Zuverlässigkeit der seriellen Bildgebung und liefert höhere z-Auflösungen³⁴. So haben beispielsweise die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) und die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) die 3D-Rekonstruktion von Ultrastrukturen mit hoher Geschwindigkeit, Effizienz und Auflösung möglich^{gemacht 35,36}. Es ist jedoch unvermeidlich, dass die Blockoberfläche mechanisch durch das Diamantmesser des SBF-REM oder durch Fräsen mit dem fokussierten Ionenstrahl des FIB-SEM^33,37 abrasiert wird. Aufgrund der Destruktivität der beiden Methoden für die Proben ist es nicht möglich, dieselbe Zielstruktur für die weitere Analyse erneut zu rekonstruieren 38,39,40. Darüber hinaus haben nur wenige Studien versucht, die 3D-Organellen-Ultrastruktur von Krebszellen mit Hilfe von EM zu rekonstruieren, um pathologische Veränderungen zu beobachten¹². Um die pathologischen Mechanismen von Krebszellen, wie z.B. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, weiter aufzuklären, schlagen wir aus diesen Gründen eine neuartige Technologie für die 3D-Rekonstruktion von Serienschnittbildern mit einem Ultramikrotom und einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FE-SEM) vor, um die mitochondriale Ultrastruktur auf Cristae-Ebene zu analysieren; Mit dieser Technologie können hochauflösende Daten mit einer effizienten und zugänglichen Methode erfasst werden. Die mit einem Ultramikrotom hergestellten seriellen ultradünnen Schnitte können semi-permanent in einem Gittergehäuse aufbewahrt und auch nach mehreren Jahren mehrfach reimaginiert werden⁴¹. FE-REM wird aufgrund seiner Fähigkeit, hochauflösende Bildgebung, hohe Vergrößerung und Vielseitigkeit zu liefern, als Werkzeug in verschiedenen Forschungsbereichen sehr geschätzt⁴². Bei dem Versuch, die Feinstruktur von Organellen in 3D darzustellen, kann die Technik zur Erzeugung serieller 2D-Bildstapel mit brauchbarer Auflösung unter Verwendung von rückgestreuten Elektronen, die durch FE-SEM^43,44 erzeugt werden^, auch verwendet werden, um eine Hochdurchsatz- und Multiskalen-Bildgebung von Zielregionen oder den zugehörigen Strukturen ohne spezielle Ausrüstung ⁴⁵ zu erreichen. Die Erzeugung von Ladungsartefakten wirkt sich direkt auf die Qualität der aufgenommenen Bilder aus, daher ist es besonders wichtig, die Verweilzeit kurz zu halten.

Die vorliegende Studie befasst sich daher mit den experimentellen Verfahren, die in dieser REM-Technik zur Rekonstruktion der 3D-Struktur der mitochondrialen Cristae^{eingesetzt werden 46}. Insbesondere zeigen wir den Prozess, der entwickelt wurde, um die halbautomatische Segmentierung von Mitochondrienregionen zu erreichen und die 3D-Rekonstruktion mit der Amira-Software zu digitalisieren, was auch die Herstellung von Schnittproben mit der konventionellen OTO-Probenvorbereitungsmethode^44,47, die Vervollständigung der Schnittentnahme mittels Ultramikrotom-Slicing und die Erfassung sequentieller 2D-Daten durch FE-SEM beinhaltet.

Protocol

1. Vorbereitung des Materials 2 x 106 Panc02-Zellen in 12 ml DMEM-Medium (10 % fötales Kälberserum und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) kultivieren und 48 Stunden lang bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft aufbewahren. Panc02-Zellen werden gesammelt, 2 Minuten lang bei 28 x g zentrifugiert und dann der Überstand verworfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe eine angemessene Größe hat (1 x 107 Z…

Representative Results

Während der Zellkultur (Abbildung 1A) teilten wir die Pankreaskarzinomzellen zunächst in eine Kontrollgruppe, die mit vollständigem Kulturmedium kultiviert wurde, eine (1S,3R)-RSL348 (RSL3, ein Ferroptoseaktivator, 100 nM) Gruppe und eine RSL3 (100 nM) plus Ferrostatin-149 (Fer-1, ein Ferroptose-Inhibitor, 100 nM) Gruppe. Durch die oben genannten experimentellen Schritte nahm das Rasterelektronenmikroskop 38 (ergänzende Abbildung 1), 43 (er…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode ist eine nützliche Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Anwendung der 3D-Rekonstruktionstechnik, bei der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitungstechnologie auf das Stapeln und Segmentieren von 2D-Tomographiebildern angewendet werden, die aus seriellen ultradünnen Schnitten erzeugt werden. Dieses Protokoll hebt eine Einschränkung von 2D-Bildern hervor, die durch die 3D-Visualisierung der Organellen-Ultrastruktur behoben werden kann, was die Vorteile einer starken Reproduzierbarkeit …

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2