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Recherche en cancérologie

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65290
, , , , , ,
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

Summary

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

Abstract

알려지지 않은 정보가 풍부할 뿐만 아니라 3차원(3D) 관점에서 정교한 세포 소기관 미세 구조의 동적 특징을 이해하는 것은 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 우수한 이미징 깊이를 제공하고 고해상도 이미지 스택을 재구성하여 나노미터 규모에서도 세포 소기관의 미세 구조적 형태를 조사할 수 있습니다. 따라서 3D 재구성은 비교할 수 없는 장점으로 인해 중요성이 커지고 있습니다. 주사전자현미경(SEM)은 연속적인 슬라이스에서 동일한 관심 영역에서 큰 구조를 3D로 재구성할 수 있는 고처리량 이미지 획득 기술을 제공합니다. 따라서 세포 소기관의 진정한 3D 미세 구조를 복원하기 위해 대규모 3D 재구성에 SEM을 적용하는 것이 점점 보편화되고 있습니다. 이 프로토콜에서는 췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 연구하기 위해 직렬 초박형 절편과 3D 재구성 기술의 조합을 제안합니다. 이러한 기술이 수행되는 방법에 대한 세부 사항은 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 방법, 직렬 초박형 단면 이미징 및 시각화 디스플레이를 포함하여 단계별로 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

Introduction

미토콘드리아는 세포에서 가장 중요한 세포 기관 중 하나입니다. 이들은 세포 생물 에너지와 신진대사의 중심 허브 역할을 하며1,2 암에 중요한 역할을 한다3. 췌장암(Pancreatic cancer, PC)은 급격한 확산과 높은 사망률로 인해 치료하기 가장 어려운 암 중 하나이다.4 미토콘드리아 기능 장애는 주로 미토콘드리아 형태 3,5,6,7의 변화에 의해 발생하며, PC 8의 기저에 있는 질병 기전과 관련이 있다. 미토콘드리아는 또한 매우 동적이며, 이는 네트워크 연결성과 크리스타 구조의 빈번하고 역동적인 변화에 의해 반영된다9. 크리스타 구조의 재형성은 미토콘드리아 기능 및 세포 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 10,11, 이는 종양 세포 성장, 전이 및 종양 미세환경 변화12,13 동안 현저하게 변화된다.

최근 몇 년 동안 과학자들은 EM 관찰14,15,16,17을 사용하여 이 세포 기관을 연구했습니다. 예를 들어, 연구자들은 3D 재구성 기술 6,7,18,19를 사용하여 미토콘드리아 역학을 분석했습니다. 전자 현미경 이미지의 3D 재구성에 대한 일반적인 개념과 방법은 일찍이 1968년에 공식적으로 확립되었습니다20 전자 현미경, 전자 회절 및 컴퓨터 이미지 처리를 결합하여 T4 파지 테일을 재구성하는 것을 포함했습니다. 지금까지 전자 현미경 3D 이미징 기술은 이미지 해상도 (21), 자동화 정도 (22) 및 처리 볼륨 (23) 측면에서 상당한 발전을 이루었으며 조직 수준에서 나노 미터 규모(24)의 세포 소기관 미세 구조 수준에 이르기까지 생물학 연구에서 점점 더 광범위한 규모로 사용되어 왔습니다. 최근 몇 년 동안, 전자 현미경 3D 이미징은 광범위한 응용 분야에서 유망한 기술이되었습니다25,26,27.

미토콘드리아 크리스타에 대한 관심 증가는 특히 초구조적 체적 이미징에 대한 필수 요구 사항을 보여줍니다. 투과 전자 현미경 (TEM)은 구리 그리드 (400 메쉬) (28)에서 수집 된 샘플을 시각화하는 데 사용되었으며, 전자빔은 섹션을 통과합니다. 그러나, 구리 그리드의 제한된 범위로 인해, 동일한 샘플(29)의 연속적인 슬라이스를 완전히 이미지화하는 것은 불가능하다. 이것은 TEM 이미징 중 표적 구조 연구를 복잡하게 만듭니다. 추가적으로, TEM은 다수의 슬라이스를 절단 및 수집하고 이들을 순차적으로 이미징하는 것을 포함하여, 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 수동 작업에 의존하므로(21), 대량의 샘플(23)의 초구조적 재구성에는 적합하지 않다. 현재 TEM 카메라 어레이(TEMCA)30 또는 2개의 2세대 TEMCA 시스템(TEMCA2)31과 같은 특수 장비를 사용하여 대용량 샘플 이미징의 고해상도 재구성을 달성하여 짧은 시간에 자동화된 고처리량 이미징을 가능하게 합니다. 그러나 이러한 유형의 이미징은 맞춤형 장비에 대한 요구 사항으로 인해 구하기 쉽고 보편적이라는 장점이 없습니다.

TEM과 비교하여, SEM(32,33)에 기초하여 넓은 영역에 대한 수천 개의 직렬 체적 이미지를 자동으로 생성하는 방법은 직렬 이미징의 효율성 및 신뢰성을 향상시키고, 더 높은 z-해상도(34)를 제공한다. 예를 들어, 직렬 블록면 주사 전자 현미경 (SBF-SEM)과 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 (FIB-SEM)은 모두 고속, 효율성 및 해상도 35,36으로 미세 구조의3D 재구성을 가능하게했습니다. 그러나 SBF-SEM의 다이아몬드 나이프 또는 FIB-SEM33,37의 집속 이온 빔으로 밀링하여 블록 표면을 기계적으로 깎는 것은 불가피합니다. 샘플에 대한 두 가지 방법의 파괴성으로 인해 추가 분석을 위해 동일한 표적 구조를 다시 재구성 할 수 없습니다38,39,40. 또한, 병리학적 변화를 관찰하기 위해 EM을 사용하여 암세포의 3차원 소기관 미세구조를 재구성하려는 연구는 거의 없었다12. 이러한 이유로 췌장암 세포와 같은 암세포의 병리학적 기전을 더 명확히 하기 위해 울트라마이크로톰과 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)을 사용하여 연속 단면 이미지를 3D로 재구성하는 새로운 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하면 효율적이고 접근 가능한 방법을 사용하여 고해상도 데이터를 획득할 수 있습니다. 울트라마이크로톰(ultramicrotome)을 사용하여 만든 직렬 초박형 절편은 그리드 케이스에 반영구적으로 저장될 수 있으며, 몇 년 후에도 여러 번 재이미징할 수 있다(41). FE-SEM은 고해상도 이미징, 고배율 및 다용성을 제공하는 능력으로 인해 다양한 연구 분야에서 도구로서 높은 평가를 받고 있습니다42. 세포 소기관의 미세 구조를 3D로 표시하기 위한 시도로, FE-SEM(43,44)에 의해 생성된 후방 산란 전자를 사용하여 유용한 해상도를 갖는 직렬 2D 이미지 스택을 생성하는 기술은 또한 특수 장비(45) 없이 표적 영역 또는 관련 구조의 높은 처리량 및 다중 스케일 이미징을 달성하는 데 사용될 수 있다. 전하 아티팩트의 생성은 획득된 이미지의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 체류 시간을 짧게 유지하는 것이 특히 중요합니다.

따라서, 본 연구는 미토콘드리아 크리스타46의 3D 구조를 재구성하기 위해 이 SEM 기술에 사용된 실험 절차에 대해 자세히 설명합니다. 특히, 미토콘드리아 영역의 반자동 분할을 달성하고 Amira 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 디지털화하기 위해 개발된 프로세스를 보여주며, 여기에는 기존의 OTO 표본 준비 방법44,47을 사용하여 슬라이스 샘플을 만들고, 울트라마이크로톰 슬라이싱을 사용하여 섹션 수집을 완료하고, FE-SEM으로 순차적 2D 데이터를 획득하는 것도 포함됩니다.

Protocol

1. 재료 준비 12mL의 DMEM 배지(10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 2 x 106 Panc02 세포를 배양하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 분위기에서 37°C 및 95% 습도를 유지합니다. Panc02 세포를 수집하고 28 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 샘플의 크기가 적절한지 확인하십시오(1 x 107 셀), 그렇지 않으면 다?…

Representative Results

세포 배양 중(그림 1A), 먼저 췌장암 세포를 완전 배양 배지로 배양한 대조군, (1S,3R)-RSL348(RSL3, 페롭토시스 활성제, 100nM) 그룹 및 RSL3(100nM)와 페로스타틴-149(Fer-1, 페롭토시스 억제제, 100nM) 그룹으로 나누었습니다. 상기의 실험 단계를 통해, 주사전자현미경은 대조군, RSL3군, 억제제군(RSL3+Fer-1기)에 대한 38(보충도 1), 43(보충?…

Discussion

여기에 제시된 방법은 직렬 초박형 섹션에서 생성된 2D 단층 촬영 이미지의 적층 및 분할에 전자 현미경 및 이미지 처리 기술을 적용하는 것과 관련된 3D 재구성 기술을 적용하기 위한 유용한 단계별 가이드입니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 미세 구조의 3D 시각화로 해결할 수 있는 2D 이미지의 한계를 강조하며, 이는 고해상도 수준에서 구조의 강력한 재현성과 더 높은 정확도의 장점이 있습니다….

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 절강성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Zhejiang Province) 보조금(Z23H290001, LY19H280001)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (82274364, 81673607 및 81774011); Huzhou 과학 기술 보조금의 공공 복지 연구 프로젝트(2021GY49, 2018GZ24). 절강 중국 의과 대학 중국 의학 아카데미 의학 연구 센터 공공 플랫폼의 큰 도움, 기술 지원 및 실험 지원에 감사드립니다.

Materials

(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929 2020.2
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).
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