En tredimensionell teknik för visualisering av mitokondriella ultrastrukturella förändringar i bukspottskörtelcancerceller

Summary

Detta protokoll beskriver hur man rekonstruerar mitokondriella cristae för att uppnå 3D-avbildning med hög noggrannhet, hög upplösning och hög genomströmning.

Abstract

Att förstå de dynamiska egenskaperna hos cellorganellens ultrastruktur, som inte bara är rik på okänd information utan också sofistikerad ur ett tredimensionellt (3D) perspektiv, är avgörande för mekanistiska studier. Elektronmikroskopi (EM) erbjuder bra bilddjup och möjliggör rekonstruktion av högupplösta bildstaplar för att undersöka den ultrastrukturella morfologin hos cellulära organeller även på nanometerskala; därför blir 3D-rekonstruktion allt viktigare på grund av dess ojämförliga fördelar. Svepelektronmikroskopi (SEM) ger en bildinsamlingsteknik med hög genomströmning som gör det möjligt att rekonstruera stora strukturer i 3D från samma intresseområde i på varandra följande skivor. Därför blir tillämpningen av SEM i storskalig 3D-rekonstruktion för att återställa den sanna 3D-ultrastrukturen hos organeller allt vanligare. I detta protokoll föreslår vi en kombination av seriell ultratunn sektion och 3D-rekonstruktionstekniker för att studera mitokondriella cristae i bukspottskörtelcancerceller. Detaljerna om hur dessa tekniker utförs beskrivs i detta protokoll steg för steg, inklusive osmium-tiokarbohydrazid-osmiummetoden (OTO), den seriella ultratunna sektionsavbildningen och visualiseringsdisplayen.

Introduction

Mitokondrier är en av de viktigaste organellerna i cellen. De fungerar som det centrala navet för cellulär bioenergetik och metabolism ^1,2 och spelar en avgörande roll i cancer³. Bukspottkörtelcancer (PC) är en av de svåraste cancerformerna⁴ att behandla på grund av dess snabba spridning och höga dödlighet. Mitokondriell dysfunktion, som främst orsakas av förändringar i mitokondriell morfologi 3,5,6,7^, har kopplats till de sjukdomsmekanismer som ligger till grund för PC⁸. Mitokondrier är också mycket dynamiska, vilket återspeglas av de frekventa och dynamiska förändringarna i deras nätverksanslutning och cristae-struktur⁹. Omformningen av cristae-strukturen kan direkt påverka mitokondriell funktion och cellulärt tillstånd^10,11, som förändras signifikant under tumörcelltillväxt, metastaser och tumörmikromiljöförändringar^12,13.

Under de senaste åren har forskare studerat denna organell med EM-observation^14,15,16,17; Till exempel har forskare analyserat mitokondriell dynamik med hjälp av 3D-rekonstruktionstekniker 6,7,18,19. Det allmänna konceptet och metoden för 3D-rekonstruktion av elektronmikroskopibilder etablerades formellt redan 1968²⁰ och involverade att kombinera elektronmikroskopi, elektrondiffraktion och datorbildbehandling för att rekonstruera T4-fagsvansen. Hittills har elektronmikroskopi 3D-avbildningsteknik gjort betydande framsteg när det gäller bildupplösning 21, automatiseringsgrad 22 och bearbetningsvolym²³ och har använts i allt bredare skala inom biologisk forskning, från vävnadsnivå till organellultrastrukturnivå på nanometerskala²⁴. Under de senaste åren har elektronmikroskopi 3D-avbildning också blivit en lovande teknik för ett brett spektrum av applikationer^25,26,27.

Den växande uppmärksamheten på mitokondriella kristor illustrerar särskilt de väsentliga kraven för ultrastrukturell volymavbildning. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) har använts för att visualisera prover som samlats in på ett kopparnät (400 mesh)²⁸, med elektronstrålen som passerar genom sektionen. På grund av kopparnätets begränsade räckvidd är det emellertid omöjligt att helt avbilda kontinuerliga skivor av samma prov²⁹. Detta komplicerar studiet av målstrukturer under TEM-avbildning. Dessutom förlitar sig TEM på tidskrävande och felbenägna manuella uppgifter, inklusive skärning och insamling av flera skivor och avbildning av dem sekventiellt²¹, så det är inte anpassat för ultrastrukturella rekonstruktioner av stora volymprover²³. För närvarande uppnås högupplöst rekonstruktion av provavbildning i stora volymer genom användning av specialutrustning, såsom TEMCA-kameramatrisen (TEMCA)³⁰ eller två andra generationens TEMCA-system (TEMCA2)³¹, som möjliggör automatiserad avbildning med hög genomströmning på kort tid. Denna typ av avbildning har dock inte fördelen att den är lätt att få och universell på grund av kravet på anpassad utrustning.

Jämfört med TEM förbättrar metoden för att automatiskt generera tusentals seriella volymetriska bilder för stora områden baserat på SEM ^32,33 effektiviteten och tillförlitligheten hos seriell avbildning och ger högre z-upplösningar³⁴. Till exempel har seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) och fokuserad jonstråleskanningselektronmikroskopi (FIB-SEM) båda gjort det möjligt att uppnå 3D-rekonstruktion av ultrastruktur med hög hastighet, effektivitet och upplösning^35,36. Det är emellertid oundvikligt att blockytan rakas mekaniskt av SBF-SEM:s diamantkniv eller genom fräsning med den fokuserade jonstrålen på FIB-SEM^33,37. På grund av de två metodernas destruktivitet för proverna är det inte möjligt att rekonstruera samma målstruktur igen för vidare analys^38,39,40. Dessutom har få studier försökt rekonstruera 3D-organellens ultrastruktur av cancerceller med hjälp av EM för att observera patologiska förändringar¹². Av dessa skäl, för att ytterligare belysa de patologiska mekanismerna hos cancerceller, såsom bukspottskörtelcancerceller, föreslår vi en ny teknik för 3D-rekonstruktion av seriella sektionsbilder med hjälp av en ultramikrotom och ett fältemissionsskanningselektronmikroskop (FE-SEM) för att analysera mitokondriell ultrastruktur på cristae-nivå; Med denna teknik kan högupplösta data förvärvas med en effektiv och tillgänglig metod. De seriella ultratunna sektionerna gjorda med hjälp av en ultramikrotom kan lagras semi-permanent i ett rutnätfodral och reimaged flera gånger, även efter flera år⁴¹. FE-SEM värderas högt som ett verktyg inom olika forskningsområden på grund av dess förmåga att tillhandahålla högupplöst bildbehandling, hög förstoring och mångsidighet⁴². I ett försök att visa organellernas fina struktur i 3D kan tekniken för att producera seriella 2D-bildstaplar med användbar upplösning med hjälp av bakåtspridda elektroner producerade av FE-SEM ^43,44 också användas för att uppnå hög genomströmning och flerskalig avbildning av målregioner eller deras associerade strukturer utan specialutrustning ⁴⁵. Genereringen av laddningsartefakter påverkar direkt kvaliteten på de förvärvade bilderna, så det är särskilt viktigt att hålla uppehållstiden kort.

Således utarbetar föreliggande studie de experimentella procedurerna som används i denna SEM-teknik för att rekonstruera 3D-strukturen hos mitokondriella cristae⁴⁶. Specifikt visar vi processen som utvecklats för att uppnå den halvautomatiska segmenteringen av mitokondriella regioner och digitalisera 3D-rekonstruktionen med hjälp av Amira-programvaran, vilket också innebär att man gör skivprover med den konventionella OTO-provberedningsmetoden^44,47, slutför sektionssamlingen med ultramikrotomskivning och förvärvar sekventiell 2D-data med FE-SEM.

Protocol

1. Förberedelse av material Odla 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10% fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillin-streptomycin) och behåll vid 37 ° C och 95% luftfuktighet i en atmosfär med 5% koldioxid och 95% luft i 48 timmar. Samla Panc02-celler, centrifugera vid 28 x g i 2 minuter och kassera sedan supernatanten. Se till att provet är av lämplig storlek (1 x 107 celler), eftersom annars kommer följande fixerings- och uttorkningsste…

Representative Results

Under cellodling (figur 1A) delade vi först bukspottkörtelcancercellerna i en kontrollgrupp odlad med komplett odlingsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptosaktivator, 100 nM) grupp och en RSL3 (100 nM) plus ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptoshämmare, 100 nM) grupp. Genom ovanstående experimentella steg förvärvade svepelektronmikroskopet 38 (kompletterande figur 1), 43 (kompletterande figur 2) och 44 (kompl…

Discussion

Metoden som presenteras här är en användbar steg-för-steg-guide för att tillämpa 3D-rekonstruktionstekniken, vilket innebär att elektronmikroskopi och bildbehandlingsteknik tillämpas på stapling och segmentering av 2D-tomografiska bilder genererade från seriella ultratunna sektioner. Detta protokoll belyser en begränsning av 2D-bilder som kan hanteras genom 3D-visualisering av organellens ultrastruktur, vilket har fördelarna med stark reproducerbarhet av strukturerna vid en hög upplösningsnivå och högre n…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2