Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität
Summary
Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.
Abstract
Modelle des Zentralnervensystems (ZNS) müssen das komplexe Netzwerk miteinander verbundener Zellen rekapitulieren, das in vivo zu finden ist.Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Aufgrund der zunehmenden Bemühungen, den Einsatz von Tieren zu ersetzen und zu reduzieren, wurde eine Vielzahl von In-vitro-Zellkultursystemen entwickelt, um die Eigenschaften angeborener Zellen zu erforschen, die die Entwicklung von Therapeutika für ZNS-Infektionen und -Pathologien ermöglichen. Während bestimmte Forschungsfragen mit humanen Zellkultursystemen beantwortet werden können, wie z. B. (induzierte) pluripotente Stammzellen, hat die Arbeit mit menschlichen Zellen ihre eigenen Grenzen in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosten und Ethik. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus embryonalen Mäusegehirnen. Die daraus resultierenden gemischten neuronalen Zellkulturen ahmen mehrere Zellpopulationen und Interaktionen nach, die im Gehirn in vivo zu finden sind. Im Vergleich zu aktuellen äquivalenten Methoden ahmt dieses Protokoll die Eigenschaften des Gehirns genauer nach und sammelt auch mehr Zellen, so dass mehr experimentelle Bedingungen an einer trächtigen Maus untersucht werden können. Darüber hinaus ist das Protokoll relativ einfach und sehr gut reproduzierbar. Diese Kulturen wurden für den Einsatz in verschiedenen Maßstäben optimiert, darunter 96-Well-basierte Hochdurchsatz-Screens, 24-Well-Mikroskopieanalysen und 6-Well-Kulturen für die Durchflusszytometrie und die Analyse der reversen Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Kulturmethode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Infektionen und Immunität im Zusammenhang mit einem Teil der Komplexität des ZNS mit der Bequemlichkeit von In-vitro-Methoden zu untersuchen.
Introduction
Die Verbesserung unseres Verständnisses des zentralen Nervensystems (ZNS) ist entscheidend, um die therapeutischen Optionen für viele neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern. Das ZNS, ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Zellen im Gehirn, Rückenmark und Sehnerven, besteht aus Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und ihren angeborenen Immunzellen, den Mikroglia1. Ein In-vitro-Ansatz kann die Anzahl der Mäuse, die für sinnvolle Forschung erforderlich sind, oft drastisch reduzieren. Die Komplexität des ZNS macht es jedoch unmöglich, die In-vivo-Situation mit Hilfe von Zelllinien zu rekapitulieren. Gemischte neuronale Zellkulturen stellen ein äußerst wertvolles Forschungswerkzeug dar, um neuro(immun)ologische Fragestellungen in einem relevanten Modell zu untersuchen, in Übereinstimmung mit den Prinzipien von Replacement, Reduction and Refinement (3R) 2,3.
Thomson et al. beschrieben eine Zellkulturmethode mit pränatalen Rückenmarkszellen, die sich in alle oben genannten Hauptzelltypen des ZNS differenzieren4. In diesem System gibt es auch Synapsenbildung, myelinisierte Axone und Ranvier-Knoten. Die Haupteinschränkung dieser Kultivierungsmethode besteht darin, dass das Rückenmark das Gehirn nicht sinnvoll modelliert und die Zellerträge ab dem 13. Embryotag (E13) das Rückenmark verengt. Dies schränkt die Anzahl der experimentellen Bedingungen ein, die untersucht werden können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein neues Zellkultursystem zu entwickeln, das die Eigenschaften des Gehirns mit erhöhter Zellausbeute rekapituliert, um die Anforderungen für Tiere zu reduzieren.
Ausgehend von Thomson et al. entwickelten wir ein Zellkulturmodell, das ausschließlich aus pränatalen Mäusegehirnen stammt. Diese Kulturen haben die gleichen Zellpopulationen, die gleiche Interkonnektivität und die gleichen Behandlungsmöglichkeiten wie die Rückenmarkskulturen, nur dass es im Vergleich weniger Myelinisierung gibt. Ein ZNS-In-vitro-Modell mit einer etwa dreimal höheren Zellausbeute ist jedoch effizienter, da weniger Mäuse und weniger Zeit für die Verarbeitung von Embryonen benötigt werden. Wir haben dieses einzigartige Kultursystem für mehrere nachgelagerte Anwendungen und Maßstäbe optimiert, einschließlich der Verwendung von Glasdeckgläsern für die Mikroskopieanalyse und verschiedener Größen von Kunststoff-Well-Platten, einschließlich 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzforschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das ZNS ist ein komplexes Netzwerk, das sich vom Gehirn bis zum Rückenmark erstreckt und aus vielen Zelltypen besteht, vor allem Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia1. Da jede Zelle eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Erzeugung angemessener Reaktionen auf Herausforderungen im ZNSspielt 9,10,11, ist ein Kultursystem, das all diese Zelltypen enthält, ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, um zu untersuchen<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Edgar- und Linington-Labors, insbesondere Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni und Dr. Katja Muecklisch, für ihre Ratschläge, hilfreichen Kommentare und Unterstützung bei der Ernährung der Kulturen während des Aufbaus dieser Kulturen. Besonderer Dank geht an Herrn Dr. Muecklisch, der die Ausgangspunkte für die Cell Profiler-Pipelines zur Verfügung gestellt hat. Diese Arbeit wurde von der MS-Gesellschaft (Stipendium 122) und der Yuri und Lorna Chernajovsky-Stiftung unterstützt. Finanzierung der Universität Glasgow für JC und MP; und Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) und Medical Research Council (MRV0109721) an GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Recherche en cancérologie. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
