次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮
Summary
このプロトコルは、目的の生物学的サンプルに対して標準化された装置を使用して、ポリ(A)RNA精製、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製を行うためのわかりやすいワークフローを提供します。
Abstract
様々なタイプのRNA転写物におけるRNA転写後修飾は、真核細胞における多様なRNA制御と関連している。RNAの5-メチルシトシン修飾の異常とRNAメチルトランスフェラーゼの発現異常は、がんを含むさまざまな疾患と関連していることが示されています。トランスクリプトームワイドの亜硫酸水素塩基配列決定は、塩基対の分解能で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。本明細書では、このプロトコルは多(A) RNAの浄化の2つの円形、重亜硫酸塩の反作用の3周期、およびmRNA 5-methylcytosineの修正の場所のトランスクリプトーム広い地図を描くことを可能にするために図書館の準備のプロシージャを詳しく示す。主反応後のRNAの量と質の評価は、RNAの完全性をモニターするために不可欠であり、高品質のシーケンシングライブラリを確保するための重要なステップです。理想的には、手続きは3日以内に完了することができます。このプロトコルでは、高品質のトータルRNAをインプットとして使用することで、目的のサンプルから次世代シーケンシング用の堅牢な亜硫酸水素-mRNAライブラリを実際に構築できます。
Introduction
150種類以上の転写後修飾1のうち、5-メチルシトシン(m5C)修飾は、リボソームRNA、トランスファーRNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、ボールトRNA、エンハンサーRNA、低分子カハール体特異的RNAなど、さまざまな種類のRNAで同定されています2。RNAm5Cは、植物の根の発生3、ウイルスの遺伝子発現4、癌の進行5の調節など、多様な生物学的および病理学的メカニズムと関連している。このプロトコルの目的は、異なる発生段階または疾患設定における生物学的サンプルのトランスクリプトームワイドmRNA m5C修飾プロファイルを特徴付けるための合理化されたパイプラインを提供することです。トランスクリプトームワイドの亜硫酸バイサルファイトシーケンシングは、塩基対の分解能6、7、8、9で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。これは、細胞内の生物学的調節機構に関与する遺伝子発現およびRNA運命とのm5Cの会合を研究する場合に特に有用である。哺乳類細胞において、2つの既知のm5Cリーダーがある:ALYREFは核でm5Cを認識することができ、mRNA核から細胞質へのトランスポーター10として機能し、一方YBX1は細胞質中のm5Cを認識し、mRNA安定化を増大させることができる11。免疫経路に関連する異常なm5C mRNAは、全身性エリテマトーデスCD4 + T細胞で報告されました12。研究により、mRNA m5C修飾とがん免疫の調節とがんの進行との関連が明らかになりました13,14。したがって、mRNA上のm5C修飾プロファイルをマッピングすることは、潜在的な調節機構を解明するための重要な情報を提供することができます。
特定の生物学的条件下でのRNA m5C修飾の機能的役割を調査するために、m5C-RIP-seq、miCLIP-seq、および5-Aza-seqなどの亜硫酸バイサルファイト変換ベース(bsRNA−seq)および抗体アフィニティーエンリッチメントベースのアプローチをハイスループットシーケンシングプラットフォームと組み合わせて、トランスクリプトームワイドスケールでm5C修飾による標的領域および配列の効率的な検出を提供することができる15、16。このプロトコルの利点は、抗体親和性濃縮ベースのアプローチが高品質の抗体の入手可能性に依存し、m5Cメチル化ランドスケープの単一フラグメント分解能を達成できるため、包括的なRNAm5Cランドスケープを単一塩基分解能で提供する17。
すべての RNA サンプルは、オリゴ (dT) ビーズを使用した 2 回の mRNA 濃縮、3 サイクルの重亜硫酸反応、およびシーケンシング ライブラリの調製で処理されます。RNAの品質を監視するために、各RNAサンプルは、mRNA精製および亜硫酸水素反応の手順の前後にキャピラリーゲル電気泳動によって検査され、フラグメント分布を評価します。精製されたライブラリは、PCRアンプリコンの品質、キャピラリーゲル電気泳動によるDNAサイズ分布フラグメント、およびシーケンシング前の蛍光色素ベースの定量アッセイによって検査されたそれらの全体的な量によって検査されます。また、農産物、単離されたビリオン、細胞株、モデル生物、病理標本など、幅広い生体試料の解析にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、標準化されたコンポーネントを利用することで、ポリ(A)濃縮、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製の詳細なパイプラインが達成されました。さらなるシーケンシング解析により、目的のサンプル中のmRNA 5-メチルシトシンが同定されました。
RNAの分解はポリ(A)RNA精製の回収率に影響を与えるため、重要なステップは出発物質であるトータルRNAの?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、台湾国家科学技術評議会の支援を受けました。[NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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