घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के माउस मॉडल में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक प्रोफाइलिंग और जीनोम-स्केल ड्रॉपआउट स्क्रीनिंग
Summary
हमने आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल और संबंधित मानव ट्यूमर प्रकार में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और तुलना करने के लिए जीनोमिक विश्लेषण और कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीन का उपयोग करके एक क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स दृष्टिकोण विकसित किया है।
Abstract
घातक परिधीय तंत्रिका शीथ ट्यूमर (एमपीएनएसटी) श्वान कोशिकाओं या उनके अग्रदूतों से प्राप्त होते हैं। ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफिब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) वाले रोगियों में, एमपीएनएसटी सबसे आम दुर्भावना और मृत्यु का प्रमुख कारण है। ये दुर्लभ और आक्रामक नरम-ऊतक सारकोमा 34-60% की 5 साल की रोग मुक्त जीवित रहने की दर के साथ एक कठोर भविष्य प्रदान करते हैं। एमपीएनएसटी वाले व्यक्तियों के लिए उपचार के विकल्प निराशाजनक रूप से सीमित हैं, जिसमें सर्जरी सबसे महत्वपूर्ण उपचार विकल्प है। कई बार आशाजनक उपचार जैसे कि टिपिफार्निब, रास सिग्नलिंग का एक अवरोधक, चिकित्सकीय रूप से विफल रहा है। इसी तरह, एर्लोटिनिब के साथ दूसरे चरण के नैदानिक परीक्षण, जो एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईएफजीआर) को लक्षित करते हैं, और सोराफेनिब, जो संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (वीईजीएफ), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर (पीडीजीएफ) और आरएएफ को लक्षित करते हैं, मानक कीमोथेरेपी के साथ संयोजन में, रोगियों में प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में विफल रहे हैं।
हाल के वर्षों में, कैंसर सेल लाइनों की आनुवंशिक प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीनिंग विधियां आवश्यक साइटोप्लाज्मिक सिग्नलिंग मार्गों की पहचान करने और लक्ष्य-विशिष्ट उपचारों के विकास के लिए उपयोगी साबित हुई हैं। दुर्लभ ट्यूमर प्रकारों के मामले में, इस दृष्टिकोण की एक भिन्नता जिसे क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स के रूप में जाना जाता है, का उपयोग तेजी से नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा रहा है। क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स में, आनुवंशिक प्रोफाइलिंग और कार्यात्मक जीनोमिक्स आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल में किए जाते हैं और परिणाम तब उपलब्ध दुर्लभ मानव नमूनों और सेल लाइनों में मान्य होते हैं।
यह पेपर बताता है कि पूरे एक्सोम अनुक्रमण (डब्ल्यूईएस) का उपयोग करके मानव और माउस एमपीएनएसटी कोशिकाओं में उम्मीदवार ड्राइवर जीन उत्परिवर्तन की पहचान कैसे करें। फिर हम वर्णन करते हैं कि माउस और मानव एमपीएनएसटी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्गों की पहचान और तुलना करने के लिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन कैसे करें और इन मार्गों में दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान करें। ये पद्धतियां विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर प्रकारों में नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करती हैं।
Introduction
घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) अत्यधिक आक्रामक स्पिंडल सेल नियोप्लाज्म हैं जो ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफिब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) के साथ मिलकर उत्पन्न होते हैं, जो सामान्य आबादी में छिटपुट रूप से और पिछले रेडियोथेरेपी 1,2,3 की साइटों पर उत्पन्न होते हैं। एनएफ 1 रोगियों का जन्म एनएफ 1 ट्यूमर शमन जीन की एक जंगली प्रकार की प्रतिलिपि और एक दूसरे एनएफ 1 एलील के साथ होता है, जिसमें हानि-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन होता है। हैप्लोअपर्याप्तता की यह स्थिति एनएफ 1 रोगियों को उनके जंगली-प्रकार एनएफ 1 जीन में दूसरे नुकसान-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है, जो ट्यूमरजेनिसिस को ट्रिगर करती है। जब यह “दूसरा हिट” एनएफ 1 उत्परिवर्तन श्वान सेल वंश में एक कोशिका में होता है, तो परिणामस्वरूप ट्यूमर या तो त्वचा में उत्पन्न होने वाला एक त्वचीय न्यूरोफिब्रोमा होता है या एक प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा होता है जो बड़ी नसों या तंत्रिका जाल में विकसित होता है। यद्यपि त्वचीय और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास की विकृति समान है, उनका जैविक व्यवहार काफी अलग है-हालांकि त्वचीय और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास दोनों सौम्य हैं, केवल प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस परिवर्तन से गुजर सकते हैं और एमपीएनएसटी को जन्म दे सकते हैं। न्यूरोफिब्रोमिन के नुकसान के अलावा, एनएफ 1 जीन द्वारा एन्कोड किए गए रास जीटीपेस-सक्रिय प्रोटीन, एमपीएनएसटी कई अन्य ट्यूमर शमन जीन ों के उत्परिवर्तन करते हैं, जिनमें टीपी 53 4,5,6,7, सीडीकेएन 2 ए8,9, और पीटीएन 10, पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स 2 11,12 (पीआरसी 2) के जीन एन्कोडिंग घटकों के उत्परिवर्तन शामिल हैं। एसयूजेड 12 और ईईडी जीन) और रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस 1,2 की असामान्य अभिव्यक्ति। एनएफ 1 और ऊपर उल्लिखित अन्य जीनों के उत्परिवर्तन छिटपुट और विकिरण-प्रेरित एमपीएनएसटी11,12 में भी मौजूद हैं।
जबकि एमपीएनएसटी में जीनोमिक असामान्यताओं की हमारी समझ में ये प्रगति उनके रोगजनन को समझने के लिए अमूल्य रही है, लेकिन उनके परिणामस्वरूप अभी तक एमपीएनएसटी के लिए प्रभावी नए उपचारों का विकास नहीं हुआ है। नए उपचारों के विकास में बाधा डालने वाली एक बड़ी बाधा यह तथ्य है कि एमपीएनएसटी दुर्लभ कैंसर हैं। इस वजह से, कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) द्वारा किए गए प्रमुख ड्राइवर म्यूटेशन को परिभाषित करने वाले वैश्विक विश्लेषण ों के लिए आवश्यक बड़ी संख्या में रोगी के नमूने प्राप्त करना मुश्किल है। हमारे अनुभव में, मानव एमपीएनएसटी नमूनों की एक मामूली संख्या जमा करने में भी वर्षों लग सकते हैं। ऐसी सीमाओं को दूर करने के लिए, अन्य दुर्लभ कैंसर प्रकारों का अध्ययन करने वाले कई जांचकर्ताओं ने आवश्यक चालक जीन उत्परिवर्तन की पहचान करने, उनके ट्यूमर में आवश्यक साइटोप्लाज्मिक सिग्नलिंग मार्गों को परिभाषित करने और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स के उपयोग की ओर रुख किया है। चूंकि ट्यूमरजेनिसिस के लिए आवश्यक सिग्नलिंग मार्ग मनुष्यों और अन्य कशेरुक प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं, इसलिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन जैसे कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण को लागू करना इन नए ड्राइवर उत्परिवर्तन, सिग्नलिंग मार्गों और चिकित्सीय लक्ष्यों 13,14,15,16,17,18,19 की पहचान करने का एक प्रभावी साधन हो सकता है।, विशेष रूप से दुर्लभ मानव ट्यूमर प्रकारों का अध्ययन करते समय जो सीमित संख्या20 में उपलब्ध हैं।
यहां प्रस्तुत पद्धतियों में, हम मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों और पी 0-जीजीएफ 3 चूहों से प्राप्त प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी संस्कृतियों में जीनोमिक प्रोफाइलिंग करने के लिए इस दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएम) जिसमें विकास कारक न्यूरेगुलिन -1 (एनआरजी 1) के श्वान सेल-विशिष्ट अतिवृद्धि प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास के रोगजनन को बढ़ावा देती है और एमपीएनएसटी21 में उनकी बाद की प्रगति को बढ़ावा देती है। 22,23. इस दृष्टिकोण में पहला कदम पी 0-जीजीएफ 3 एमपीएनएसटी, मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों और शल्य चिकित्सा द्वारा निकाले गए मानव एमपीएनएसटी में उम्मीदवार ड्राइवर जीन की पहचान करना है। इन उत्परिवर्तनों से प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों को कार्यात्मक रूप से मान्य करने के लिए, हम मानव और माउस एमपीएनएसटी सेल लाइनों में प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन का उपयोग करते हैं। प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के बाद, हम ड्रग जीन इंटरैक्शन डेटाबेस का उपयोग करके “हिट्स” के संग्रह के भीतर दवा योग्य जीन उत्पादों की पहचान करते हैं। हम मानव और माउस एमपीएनएसटी कोशिकाओं में “हिट्स” की तुलना भी करते हैं, यह निर्धारित करने के लिए कि जीईएम मॉडल और मानव एमपीएनएसटी एक ही जीन और सिग्नलिंग मार्गों पर समान निर्भरता प्रदर्शित करते हैं या नहीं। प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन और प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों में ओवरलैप की पहचान करना आणविक स्तर पर पी 0-जीजीएफ 3 माउस मॉडल को मान्य करने के साधन के रूप में कार्य करता है। यह दृष्टिकोण उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए मानव और माउस स्क्रीन के संयोजन की प्रभावशीलता पर भी जोर देता है, जहां माउस मॉडल मानव स्क्रीन के पूरक के रूप में काम कर सकता है। दुर्लभ ट्यूमर में चिकित्सीय लक्ष्यों की तलाश करते समय इस क्रॉस-प्रजाति दृष्टिकोण का मूल्य विशेष रूप से स्पष्ट है, जहां मानव ट्यूमर और सेल लाइनों को प्राप्त करना मुश्किल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विस्तृत तरीकों को परिधीय तंत्रिका तंत्र नियोप्लासिया और एमपीएनएसटी रोगजनन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। यद्यपि हमने इन तरीकों को प्रभावी पाया है, यह माना जाना चाहिए कि हमार?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक (आर 01 NS048353 और आर 01 NS109655 एसएलसी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; R01 NS109655-03S1 से D.P.J.), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01 CA122804 S.L.C.), और रक्षा विभाग (X81XWH-09-1-0086 और W81XWH-12-1-0164 से S.L.C.)।
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
