פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית
Summary
פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.
Abstract
גידולי מעטפת עצב היקפית ממאירים (MPNST) נגזרים מתאי Schwann או מבשריהם. בחולים עם תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1), MPNST הם הממאירות הנפוצה ביותר וסיבת המוות המובילה. סרקומות נדירות ואגרסיביות אלה של רקמות רכות מציעות עתיד עגום, עם שיעורי הישרדות ללא מחלות במשך 5 שנים של 34-60%. אפשרויות הטיפול עבור אנשים עם MPNST מוגבלות באופן מאכזב, כאשר ניתוח מעוות הוא אפשרות הטיפול המובילה. טיפולים רבים שהיו בעבר מבטיחים כגון tipifarnib, מעכב איתות Ras, נכשלו קלינית. כמו כן, ניסויים קליניים שלב II עם erlotinib, אשר מכוון גורם גדילה אפידרמיס (EFGR), ו sorafenib, אשר מכוון קולטן גורם גדילה אנדותל כלי הדם (VEGF), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות (PDGF), ו Raf, בשילוב עם כימותרפיה סטנדרטית, גם לא הצליחו לייצר תגובה בחולים.
בשנים האחרונות, שיטות סינון גנומיות תפקודיות בשילוב עם פרופיל גנטי של קווי תאים סרטניים הוכחו כיעילות לזיהוי מסלולי איתות ציטופלזמיים חיוניים ולפיתוח טיפולים ספציפיים למטרה. במקרה של סוגי גידולים נדירים, וריאציה של גישה זו המכונה אונקוגנומיקה השוואתית בין מינים משמשת יותר ויותר לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות. באונקוגנומיקה השוואתית בין מינים, פרופיל גנטי וגנומיקה פונקציונלית מבוצעים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) והתוצאות מאומתות לאחר מכן בדגימות האנושיות הנדירות ובקווי התאים הזמינים.
מאמר זה מתאר כיצד לזהות מוטציות גנטיות של מניעים מועמדים בתאי MPNST אנושיים ועכבריים באמצעות ריצוף אקסומי שלם (WES). לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מסכי shRNA בקנה מידה גנומי כדי לזהות ולהשוות מסלולי איתות קריטיים בתאי MPNST של עכברים ובני אדם ולזהות מטרות ניתנות לסמים במסלולים אלה. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות במגוון סוגי סרטן אנושיים.
Introduction
גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים (MPNST) הם גידולים אגרסיביים ביותר של תאי ציר המתעוררים בקשר עם תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1), באופן ספורדי באוכלוסייה הכללית ובאתרים של הקרנות קודמות 1,2,3. חולי NF1 נולדים עם עותק פראי של הגן מדכא הגידול NF1 ואלל NF1 שני עם מוטציה של אובדן תפקוד. מצב זה של אי ספיקת הפלואים הופך את חולי NF1 לפגיעים למוטציה שנייה של אובדן תפקוד בגן NF1 הפראי שלהם, המעוררת גידולים. כאשר מוטציית NF1 “מכה שנייה” זו מתרחשת בתא בשושלת תאי Schwann, הגידול שנוצר הוא נוירופיברומה עורית המתעוררת בעור או נוירופיברומה פרספקס המתפתחת בעצבים גדולים או מקלעי עצבים. למרות שהפתולוגיה של נוירופיברומות עוריות ופרסיפורמות זהה, ההתנהגות הביולוגית שלהם שונה למדי – למרות שגם נוירופיברומות עוריות וגם פרספורמיות הן שפירות, רק נוירופיברומות פרספקס יכולות לעבור טרנספורמציה ולעורר MPNSTs. בנוסף לאובדן נוירופיברומין, החלבון מפעיל Ras GTPase המקודד על ידי הגן NF1, MPNST נושאים מוטציות של גנים מדכאי גידול רבים אחרים, כולל TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 ו- PTEN 10, מוטציות של גנים המקודדים רכיבים של קומפלקס דיכוי פוליקומב 2 11,12 (PRC2; גנים SUZ12 ו-EED) וביטוי חריג של קולטן טירוזין קינאזות 1,2. מוטציות של NF1 והגנים האחרים שצוינו לעיל קיימות גם ב- MPNST ספורדיים והמושרים על ידי קרינה11,12.
בעוד שהתקדמות זו בהבנתנו את החריגות הגנומיות ב- MPNST הייתה רבת ערך להבנת הפתוגנזה שלהם, הם עדיין לא הביאו לפיתוח טיפולים חדשים ויעילים עבור MPNST. חסם מרכזי המעכב פיתוח טיפולים חדשים הוא העובדה כי MPNST הם סוגי סרטן נדירים. מסיבה זו, קשה להשיג את המספר הגדול של דגימות חולים הדרושות לניתוחים גלובליים המגדירים מוטציות מניעות מרכזיות כגון אלה שבוצעו על ידי אטלס גנום הסרטן (TCGA). מניסיוננו, צבירת אפילו מספר צנוע של דגימות MPNST אנושיות יכולה לקחת שנים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, חוקרים רבים החוקרים סוגי סרטן נדירים אחרים פנו לשימוש באונקוגנומיקה השוואתית בין מינים כדי לזהות מוטציות גנטיות מניעות חיוניות, להגדיר את מסלולי האיתות הציטופלזמיים החיוניים בגידול המעניין אותם, ולזהות מטרות טיפוליות חדשות. מכיוון שמסלולי האיתות החיוניים לגידולים נשמרים מאוד בין בני אדם למיני חולייתנים אחרים, יישום גישות גנומיות פונקציונליות כגון מסכי shRNA בקנה מידה גנומי יכול להיות אמצעי יעיל לזיהוי מוטציות מניעות חדשות אלה, מסלולי איתות ומטרות טיפוליות 13,14,15,16,17,18,19 במיוחד כאשר חוקרים סוגי גידולים נדירים בבני אדם הזמינים במספרים מוגבליםשל 20.,
במתודולוגיות המוצגות כאן, אנו מתארים גישה זו לביצוע פרופיל גנומי בקווי תאי MPNST אנושיים ותרביות MPNST מוקדמות שמקורן בעכברי P 0-GGFβ3, מודל עכבר מהונדס גנטית (GEM) שבו ביטוי יתר ספציפי לתאי Schwann של גורם הגדילה neuregulin-1 (NRG1) מקדם את הפתוגנזה של נוירופיברומות פרסידיפורמיות ואת התקדמותן לאחר מכן ל- MPNSTs 21, 22,23. הצעד הראשון בגישה זו הוא לזהות גנים מניעים מועמדים ב- P 0-GGFβ3 MPNSTs, קווי תאי MPNST אנושיים ו- MPNST אנושיים שעברו ניתוח. כדי לאמת באופן פונקציונלי את מסלולי האיתות המושפעים מהמוטציות האלה, אנו משתמשים במסכי shRNA בקנה מידה גנומי כדי לזהות את הגנים הדרושים להתרבות ולהישרדות בשורות תאי MPNST אנושיים ועכבריים. לאחר זיהוי הגנים הדרושים להתרבות ולהישרדות, אנו מזהים את תוצרי הגנים הניתנים לתרופות בתוך אוסף ה”להיטים” באמצעות מסד הנתונים של אינטראקציה בין גנים של תרופות. אנו גם משווים את ה”פגיעות” בתאי MPNST אנושיים ובעכברים, כדי לקבוע אם מודל GEM ו- MPNST אנושיים מפגינים תלות דומה באותם גנים ומסלולי איתות. זיהוי חפיפות בגנים הדרושים להתרבות ולהישרדות ומסלולי האיתות המושפעים משמש כאמצעי לאימות מודל העכבר P 0-GGFβ3 ברמה המולקולרית. גישה זו מדגישה גם את היעילות של שילוב מסכים אנושיים ועכבריים לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות, כאשר מודל העכבר יכול לשמש כהשלמה למסכים האנושיים. הערך של גישה חוצת מינים זו בולט במיוחד כאשר מחפשים מטרות טיפוליות בגידולים נדירים, שבהם קשה להשיג גידולים אנושיים וקווי תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המפורטות המוצגות כאן פותחו כדי לחקור neoplasia מערכת העצבים ההיקפית ופתוגנזה MPNST. למרות שמצאנו שיטות אלה כיעילות, יש להכיר בכך שיש כמה מגבלות פוטנציאליות לשיטות שאנו מתארים כאן. להלן, נדון בכמה ממגבלות אלה ובאסטרטגיות אפשריות להתגבר עליהן במערכות מודל אחרות.
מצאנו כי ריצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS048353 ו- R01 NS109655 ל- S.L.C.; R01 NS109655-03S1 ל- D.P.J.), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804 ל- S.L.C.), ומשרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086 ו- W81XWH-12-1-0164 ל- S.L.C).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
