Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей
Summary
Представлен протокол хирургической имплантации стабилизированного постоянного оптического окна для субклеточной визуализации поджелудочной железы мышей, позволяющий проводить серийные и лонгитюдные исследования здоровой и больной поджелудочной железы.
Abstract
Физиология и патофизиология поджелудочной железы сложны. Заболевания поджелудочной железы, такие как панкреатит и аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Прижизненная визуализация (ВВИ) — это мощный метод, позволяющий получать изображения тканей с высоким разрешением как в здоровом, так и в больном состоянии, что позволяет наблюдать за динамикой клеток в режиме реального времени. ИВИ поджелудочной железы мышей представляет собой серьезную проблему из-за глубокой висцеральной и податливой природы органа, что делает его очень подверженным повреждениям и артефактам движения.
Здесь описан процесс имплантации S-табилизированного W-индудля визуализациимышиного P-ancreas(SWIP). SWIP позволяет проводить внутривенное введение поджелудочной железы мышей в нормальном здоровом состоянии, во время трансформации здоровой поджелудочной железы в острый панкреатит, индуцированный церулеином, и при злокачественных состояниях, таких как опухоли поджелудочной железы. В сочетании с генетически мечеными клетками или введением флуоресцентных красителей, SWIP позволяет измерять динамику одиночных клеток и субклеток (включая одноклеточную и коллективную миграцию), а также получать последовательные изображения одной и той же области интереса в течение нескольких дней.
Способность улавливать миграцию опухолевых клеток имеет особое значение, поскольку основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является подавляющее метастатическое бремя. Понимание физиологической динамики метастазирования при ОАК является критической неудовлетворенной потребностью и имеет решающее значение для улучшения прогноза пациента. В целом, SWIP обеспечивает улучшенную стабильность визуализации и расширяет область применения IVI при здоровых заболеваниях поджелудочной железы и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы.
Introduction
Доброкачественные и злокачественные заболевания поджелудочной железы потенциально опасны для жизни, при этом существуют значительные пробелы в понимании их патофизиологии. Панкреатит – воспаление поджелудочной железы – является третьей по значимости причиной госпитализаций и повторных госпитализаций в связи с желудочно-кишечными заболеваниями в США и связан со значительной заболеваемостью, смертностью и социально-экономическим бременем. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), занимающая третье место среди основныхпричин смертности, связанной с раком, является причиной большинства злокачественных новообразований поджелудочной железы3 и предвещает низкую 5-летнюю выживаемость — всего 11%2. Основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является чрезмерная метастатическая нагрузка. К сожалению, у большинства пациентов наблюдается метастатическое заболевание. Таким образом, понимание динамики метастазирования при PDAC является критической неудовлетворенной потребностью в области исследования рака.
Механизмы, лежащие в основе воспаления и метастатического каскада поджелудочной железы, плохо изучены. Основной причиной этого пробела в знаниях является невозможность наблюдать клеточную динамику поджелудочной железы in vivo. Непосредственное наблюдение за этой клеточной динамикой обещает выявить важнейшие мишени для использования и улучшения диагностики и лечения пациентов с заболеваниями поджелудочной железы.
Прижизненная визуализация (ВВИ) — это метод микроскопии, который позволяет исследователям визуализировать и изучать биологические процессы у живых животных в режиме реального времени. IVI позволяет с высоким разрешением напрямую визуализировать динамику внутриклеточной и микроокружающей среды in vivo и в естественной среде рассматриваемого биологического процесса. Таким образом, IVI позволяет in vivo наблюдать за здоровыми и патологическими процессами.
Современные методы визуализации всего тела, такие как МРТ, ПЭТ и КТ, обеспечивают превосходное изображение целых органов и могут выявлять патологии еще до появления клинических симптомов4. Однако они не способны достичь одноклеточного разрешения или выявить самые ранние стадии заболевания – панкреатита или злокачественных новообразований.
В предыдущих исследованиях для наблюдения за доброкачественными и злокачественными заболеваниями кожи5,6, молочной железы7, легких8, печени9, головного мозга10 и поджелудочной железы 11 использовалось одноклеточное разрешение, что привело к пониманию механизмов прогрессирования заболевания12. Тем не менее, поджелудочная железа мышей создает значительные препятствия для достижения разрешения одной клетки с помощью IVI, в первую очередь из-за ее глубокого висцерального расположения и высокой податливости. Кроме того, это разветвленный, диффузно распределенный орган в брыжейке, который соединяется с селезенкой, тонкой кишкой и желудком, что затрудняет доступ к нему. Ткань также очень чувствительна к движению, вызванному прилегающей перистальтикой и дыханием. Минимизация движения поджелудочной железы имеет важное значение для микроскопии с одноклеточным разрешением, поскольку артефакты движения даже в несколько микрон могут размывать и искажать изображения, что делает невозможным отслеживание динамики отдельных клеток13.
Для проведения ВВИ хирургическим путем должно быть имплантировано окно визуализации брюшной полости (AIW) 9,11. Для хирургической имплантации AIW в брюшную стенку вшивается металлическая оконная рама. После этого интересующий орган крепится к каркасу с помощью цианоакрилатного клея. Хотя этого достаточно для некоторых жестких внутренних органов (например, печени, селезенки, ригидных опухолей), попытки визуализации здоровой поджелудочной железы мышей нарушаются из-за неоптимальной латеральной и осевой стабильности из-за податливой текстуры ткани и сложной архитектуры14. Чтобы устранить это ограничение, Park et al.14 разработали окно визуализации, специально предназначенное для здоровой поджелудочной железы. Это окно визуализации поджелудочной железы (PIW) сводит к минимуму влияние кишечника и дыхания за счет горизонтальной металлической полки в оконной раме, прямо под покровным стеклом, стабилизируя ткань и поддерживая ее контакт с покровным стеклом. Несмотря на то, что PIW обеспечивает повышенную латеральную стабильность, мы обнаружили, что это окно по-прежнему демонстрирует осевой дрейф и дополнительно препятствует визуализации крупных солидных опухолей из-за узкого зазора между металлической полкой и покровным стеклом15.
Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали S-табилизированный W-индудля визуализации мышиного P-ancreas(SWIP), имплантируемое окно визуализации, способное обеспечить стабильную долгосрочную визуализацию как здоровой, так и больной поджелудочной железы (рис. 1)15. Здесь мы предоставляем исчерпывающий протокол хирургической процедуры, используемой для имплантации SWIP. Хотя основной целью было изучение динамических механизмов, участвующих в метастазировании, этот метод также может быть использован для изучения различных аспектов биологии и патологии поджелудочной железы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол SWIP, описанный здесь, обеспечивает улучшенный метод стабилизации тканей поджелудочной железы с использованием техники вышивки корзиной крестиком. Ранние окна визуализации брюшной полости (AIW) позволяли проводить прижизненную визуализацию (IVI) внутренних органов брюшной полос…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благотворительный фонд Эвелин Липпер, Центр биофотоники Грусса-Липпера, Программа комплексной визуализации для исследования рака, стипендия NIH T-32 (CA200561) и грант Программы исследования рака поджелудочной железы Министерства обороны США (PCARP) PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. . How To Passivate Stainless Steel Parts. , (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
