Summary

Venöser Thrombose-Assay in einem Mausmodell für Krebs

Published: January 05, 2024
doi:

Summary

Dieser Artikel zielt darauf ab, eine optimierte Methode zur Beurteilung von Venenthrombosen in einem Mauskrebsmodell vorzustellen, bei der Gefäßclips verwendet werden, um eine venöse Ligatur zu erreichen. Die Optimierung minimiert die Variabilität bei thrombosebedingten Messungen und erhöht die Relevanz für krebsassoziierte Venenthrombosen beim Menschen.

Abstract

Diese methodische Arbeit beleuchtet die chirurgischen Nuancen eines Nagetiermodells der Venenthrombose, insbesondere im Zusammenhang mit der krebsassoziierten Thrombose (CAT). Eine tiefe Venenthrombose ist eine häufige Komplikation bei Krebsüberlebenden und kann potenziell tödlich sein. Bei den aktuellen murinen Venenthrombosemodellen kommt es in der Regel zu einem vollständigen oder teilweisen mechanischen Verschluss der Vena cava inferior (IVC) mittels Naht. Dieses Verfahren induziert eine vollständige oder teilweise Stauung von Blut und Endothelschäden, die eine Thrombogenese auslösen. Die aktuellen Modelle weisen Einschränkungen auf, wie z. B. eine höhere Variabilität der Gerinnselgewichte, eine signifikante Mortalitätsrate und eine verlängerte Lernkurve. In diesem Bericht werden chirurgische Verfeinerungen mit Gefäßklammern vorgestellt, um einige dieser Einschränkungen zu beheben. Unter Verwendung eines syngenen Dickdarmkrebs-Xenotransplantat-Mausmodells verwendeten wir maßgeschneiderte Gefäßclips, um die Hohlvene infrarenale Hohlvene zu ligieren. Diese Clips ermöglichen einen Restlippenraum, ähnlich wie bei einem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial nach IVC-Ligaturen. Mäuse mit der Nahtmethode dienten als Kontrollen. Die Gefäßclip-Methode führte zu einem konsistent reproduzierbaren partiellen Gefäßverschluss und höheren Gerinnselgewichten bei geringerer Variabilität als die Nahtmethode. Die größeren Gerinnselgewichte, die größere Gerinnselmasse und das Gerinnsel auf der luminalen IVC-Oberfläche wurden aufgrund des höheren Druckprofils der Gefäßclips im Vergleich zu einer 6-0-Polypropylennaht erwartet. Der Ansatz wurde durch eine Graustufensonographie validiert, die im Vergleich zur Nahtmethode eine durchweg größere Gerinnselmasse in der infrarenalen Hohlvene mit Gefäßclips zeigte. Diese Beobachtungen wurden durch die Immunfluoreszenzfärbung weiter untermauert. Diese Studie bietet eine verbesserte Methode zur Generierung eines venösen Thrombosemodells in Mäusen, die zur Vertiefung des mechanistischen Verständnisses der CAT und in der translationalen Forschung wie der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Introduction

Krebsassoziierte venöse Thromboembolie (VTE)
Das Risiko für venöse Thromboembolien (VTE) ist bei Krebsüberlebenden 4- bis 7-mal höher als in der Allgemeinbevölkerung 1,2,3. Dieser Zustand verläuft bei einem von sieben Krebspatienten tödlich. Die Inzidenz von VTE variiert je nach Krebsart und Tumorlast und ist bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsen- und Magenkrebs am höchsten4.

Die krebsassoziierte VTE bei Krebspatienten hat eine prognostische Bedeutung. Sie ist mit einem ungünstigen Gesamtüberleben im ersten Jahr nach einer Krebsdiagnose verbunden, auch nach Anpassung an Alter, Rasse und Stadium der zugrunde liegenden Krebserkrankung5. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung der krebsassoziierten VTE und die Notwendigkeit, ihren Mechanismus anhand eines Tiermodells zu untersuchen. Die translationale Relevanz dieses Bereichs wird auch dadurch unterstrichen, dass VTE bei Krebspatienten vermeidbar und mit Thromboprophylaxe und antithrombotischer Therapie behandelbar ist6.

Tiermodelle für Krebs und Venenthrombose
Krebsmodelle werden konventionell als Xenotransplantate bezeichnet, bei denen Mäusen Krebszellen injiziert werden. Die Injektion von Krebszellen an einer Stelle wie ihrem Ursprung wird als orthotopes Modell bezeichnet, während an einer anderen Stelle (subkutane Ebene über der Flanke) als heterotopes Modell bezeichnet wird. Die Ursprungsart von Krebszellen bestimmt sie als allogenes Modell, wie z.B. die HT-29-Zelllinie (menschlicher Darmkrebs)7,8,9. Im Gegensatz dazu verwenden syngene Modelle die murinen Krebszelllinien, einschließlich RenCa- und MC-38-Zelllinien 3,10.

In der Literatur werden arterielle, venöse und kapillare Thrombosemodelle bei Nagetieren beschrieben. Die Venenthrombose wird in der unteren Hohlvene (IVC) durch mechanische Verletzung (Führungsdraht) oder vollständige IVC-Ligatur, chemische (Eisenchlorid) oder elektrolytische Schädigung induziert. Die Eisenchlorid-induzierte Thrombose oder IVC-Ligatur stellt ein vollständiges Okklusionsmodell dar. Letzteres führt zur Stauung von Blut und entzündlichen Infiltraten in den Venen11,12,13. Das vollständige Ligationsmodell führt zu einer hohen Thrombosebildungsrate bei 95% bis 100% der Mäuse. Das partielle IVC-Ligaturmodell kann eine Unterbrechung der lateralen iliolumbalen Äste beinhalten, und der venöse Rückfluss wird durch die Anwendung von Nahtligaturen an den distalen Zielpunkten von IVC12 aufgehoben. Manchmal wird ein Platzhalter verwendet, um den venösen Rückfluss teilweise zu unterbrechen. Das Thrombusgewicht ist jedoch im aktuellen partiellen Okklusionsmodell inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität der Gerinnselgewichte und -höhen führt12,14.

Beide großen mechanischen Modelle (partiell und vollständig) haben ihre Grenzen. Erstens führt die IVC-Ligatur (Stasismodell) häufig zu einer Hypotonie. Das Blut wird durch die Wirbelvenen geleitet. In erfahrenen Händen liegt die Sterblichkeit bei diesem Modell zwischen 5 % und 30 %, wobei die höhere Rate während der Lernkurve zu erwarten ist. Wichtig ist, dass das vollständige Okklusionsmodell keine tiefe Venenthrombose (TVT) beim Menschen reproduziert, bei der ein Thrombus in der Regel nicht okklusiv ist. Ein vollständiger Verschluss verändert wahrscheinlich hämorheologische Faktoren und pharmakodynamische Parameter, wodurch sich die Bioverfügbarkeit von Verbindungen an der lokalen Stelle verändert. Aufgrund dieser Einschränkungen sind vollständige Okklusionsmodelle möglicherweise nicht optimal für die Prüfung neuartiger chemischer Verbindungen für therapeutische Zwecke und Arzneimittelentdeckungen12.

Es sollte beachtet werden, dass zur Bereitstellung eines klinisch relevanteren murinen Modells der Venenthrombose mit vermindertem Fluss und endothelialer Schädigung ein venöses Thrombosemodell eingeführt wurde, bei dem die TVT durch die Einschränkung des Blutflusses ohne Endothelstörung ausgelöst wird. Das Modell wurde mittels Rasterelektronenmikroskopievalidiert 15. Ein bevorzugtes klinisch relevantes Thrombosemodell ist ein Modell mit nahezu vollständiger Thrombose, das die Entdeckung von Medikamenten ermöglicht. Die Gerinnselbildung in den aktuellen partiellen Okklusionsmodellen ist inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität des Gerinnselgewichts und der Gerinnselhöhen führt12,16. Darüber hinaus ist das Gerinnselgewicht bei den herkömmlichen Methoden variabel, so dass mehr Mäuse pro Studie benötigtwerden 12.

Bisherige krebsassoziierte Thrombosemodelle konzentrierten sich auf Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen- und Lungenkrebs und waren alle vollständige Okklusionsmodelle17,18,19. Dieses Manuskript modifiziert das partielle Okklusionsthrombosemodell, um Gerinnsel mit geringerer Variabilität und Mausmortalität bereitzustellen (Abbildung 1). In früheren Studien wurden allogene Krebszelllinien an immungeschwächten athymischen Mäusen verwendet Hintergrund 19,20,21. In diesem Manuskript wird ein syngenes MC-38-Zell-Xenotransplantat in C57Bl6/J-Mäusen verwendet, das die Verwendung von immunkompetenten Mäusen und die Untersuchung von Immunkomponenten zur Thrombogenese ermöglicht.

Protocol

Für diese Studie wurden 16 weibliche C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Körpergewicht von 20 bis 25 g verwendet. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser gefüttert. Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Boston University durchgeführt. Die hier beschriebenen offenen Eingriffe wurden in sterilem Zustand durchgeführt. 1. Xenograft-Modell</p…

Representative Results

Einer Gruppe weiblicher C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen wurden MC-38-Zellen in der logarithmischen Phase des Zellwachstums injiziert. Die Xenotransplantate wuchsen zwischen der dritten und vierten Woche nach der Injektion schnell18. Sobald die Tumore ein durchschnittliches Volumen von 400mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in die Kontroll- und Experimentalgruppe eingeteilt. Die Kontrollgruppe wurde einer IVC-Ligatur mit Naht unterzogen, während die V…

Discussion

In einem syngenen Xenotransplantat-Kolonkarzinommodell beobachten wir in der Experimentalgruppe eine höhere Thrombogenität und Expression von Gerinnungsmarkern im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wichtig ist, dass die Varianz all dieser Parameter in der Experimentalgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer war. Die Modifikation beinhaltete die Einführung eines Gefäßclips mit einem spezifischen Druckprofil am Konfluenzpunkt der IVC und der linken Nierenvene. Der Clip wurde über einen Abstandshalter gelegt, bei de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078 (KR, VCC, XY und SL) und R01HL166608 (KR und VCC) unterstützt.

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
Caliper VWR International, Radnor, PA 12777-830
CD31 Abcam Ab9498
Cell Counter MOXIE MXZ000
Clamp  Fine Science Tools    13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, Accurate Surgical & Scientific Instruments PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Fibrin Millipore MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Isoflurane, USP  Covetrus NDC 11695-6777-2
MC-38 cell Sigma Aldrich SCC172
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Scissors  Fine Science Tools   14079-10
Suture- Vicryl AD-Surgical #L-G330R24
Suture-Nylon 2-0 Ethilon 664H
Suture-Prolene 5-0 Ethicon 8661G
Suture-Prolene 6-0 Ethicon PDP127
VEV03100 VisualSonics FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix The Well Bioscience VHM01 

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Citer Cet Article
Lotfollahzadeh, S., Yang, X., Wu Wong, D. J., Han, J., Seta, F., Ganguli, S., Jose, A., Ravid, K., Chitalia, V. C. Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer. J. Vis. Exp. (203), e65518, doi:10.3791/65518 (2024).

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