Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster
Summary
Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.
Abstract
As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.
Introduction
A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolvimento de larvas de terceiro ínstar, que são prontamente observados por microscopia. No estágio larval de terceiro ínstar, há cerca de 100 RNs presentes em cada lobo cerebral central3,4,5,6.
A divisão celular assimétrica é um processo altamente dinâmico. Protocolos de imagem de células vivas têm sido utilizados para medir e quantificar a dinâmica da polaridade celular 7,8,9,10, a orientação do fuso 11,12,13, a dinâmica do córtex da actomiosina14,15,16,17,18, a biologia dos microtúbulos e centrossomos 19,20,21,22,23,24,25,26,27, e membrana 10,28 e dinâmica da cromatina29. Descrições qualitativas e quantitativas de DCA baseiam-se em métodos e protocolos robustos para a divisão de imagens de RNs em cérebros vivos intactos. O protocolo a seguir descreve métodos para preparar, dissecar e obter imagens de cérebros de larvas de terceiro ínstar para imagens de células vivas in vivo usando duas abordagens de montagem diferentes. Esses métodos são mais adequados para pesquisadores interessados na dinâmica espaço-temporal de divisões de células-tronco, bem como divisões em outras células cerebrais, pois permitem observações de curto e longo prazo de eventos celulares. Além disso, essas técnicas são facilmente acessíveis aos recém-chegados ao campo. Nós demonstramos a eficácia e adaptabilidade desta abordagem com cérebros de larvas expressando microtúbulos fluorescentemente marcados e proteínas de fusão cortical. Além disso, discutimos métodos de análise e considerações para aplicação em outros estudos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcança…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Biologie du développement. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Biologie du développement. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
