Summary
本方案描述了一种RNA荧光 原位 杂交以在人骨肉瘤细胞中定位lncRNA的方法。
Abstract
已经研究了长链非编码RNA(lncRNA)在癌症中的重要作用,如调节癌细胞的增殖、上皮-间充质转化(EMT)、迁移、浸润和自噬。细胞中lncRNA的定位检测可以深入了解其功能。通过设计lncRNA特异性反义链序列,然后用荧光染料标记,RNA荧光 原位 杂交(FISH)可用于检测lncRNA的细胞定位。随着显微镜的发展,RNA FISH技术现在甚至可以对表达不良的lncRNA进行可视化。该方法不仅可以单独检测lncRNA的定位,还可以利用双色或多色免疫荧光检测其他RNA、DNA或蛋白质的共定位。在此,我们以人骨肉瘤细胞中的lncRNA小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)为例,对RNA FISH的详细实验操作步骤和注意事项进行了介绍,以期为想要进行RNA FISH实验,尤其是lncRNA FISH的研究人员提供参考。
Introduction
近年来,全基因组技术的进步极大地扩展了我们对人类基因组的理解。大约93%的人类基因组可以转录成RNA,但只有2%的RNA可以翻译成蛋白质;其余 98% 没有蛋白质翻译功能的 RNA 称为非编码 RNA (ncRNA)1。长链 ncRNA (lncRNA) 是一类非编码 RNA (ncRNA) 中含有 200 多个核苷酸2,由于参与细胞的许多生理和病理过程,如分化、周期调控、凋亡、迁移和侵袭 3,4,5,因此越来越受到关注.LncRNA通过调节染色质结构和核基因表达、控制mRNA剪接过程和转录后修饰等多种机制发挥作用6。LncRNA在转录和转录后水平上调节恶性肿瘤的发生、发展和转移。转录调控是通过与染色体结构结合影响 RNA 转录在细胞核中实现的,而转录后调控是通过内源性竞争性 RNA (ceRNA) 机制控制靶基因在细胞质中实现的 5,7,8。CeRNA揭示了一种新的RNA相互作用机制,即lncRNA可以作为海绵吸附miRNA,抑制miRNA介导的相关靶基因降解9。因此,有关lncRNA的亚细胞定位的信息,无论特定的lncRNA位于细胞质还是细胞核中,对于帮助确定其生物学功能都很重要。
目前,lncRNA定位主要通过两种方法进行检测,一种是通过细胞核/细胞质组分分离试验,另一种是通过RNA FISH。在前者中,分别提取细胞质和细胞核组分中的RNA,然后用特异性lncRNA引物进行PCR扩增,以检测细胞质和细胞核中lncRNA的比例。这种方法的优点是时间效率高,而缺点是实际的lncRNA定位不能直接反映在细胞质和细胞核中lncRNA的相对比例上。RNA FISH可以通过设计lncRNA特异性反义链序列,然后用荧光染料标记来检测细胞中的lncRNA定位10。随着探针技术和检测方法的进步,RNA FISH方法得到了改进,包括荧光团标记的多个寡核苷酸探针组11、LNA探针12和支链DNA(bDNA)探针13。RNA FISH不仅可以检测lncRNA的定位,还可以使用双色或多色免疫荧光14检测其他RNA、DNA或蛋白质的共定位。
在这项工作中,我们以RNA FISH在骨肉瘤细胞(143B)中lncRNA小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)的详细细胞内定位检测方案为例。SNHG6 是一种 600-730 核苷酸的成熟剪接形式的 lncRNA,被鉴定为多种人类癌症的新型致癌基因,包括结直肠癌、胃癌、卵巢透明细胞癌、骨肉瘤和肝细胞癌15、16、17、18。研究证实了 SNHG6 参与癌细胞的生物学行为,例如增殖、EMT 和自噬,并显示了 SNHG6 的细胞质定位,它可能通过结合(海绵化)miRNA15、16、17 来影响靶基因。本文介绍了通过RNA FISH进行SNHG6细胞内定位的详细检测方案。
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Protocol
有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息,请参阅 材料表 。 图1 显示了RNA FISH的整体方案;表 1 包含所有溶液的组成, 表2 包含该协议中使用的引物序列。
1. 探针准备
- 识别并获取目标靶标 lncRNA 的 FASTA 序列,例如从 GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。按照网站上的指示,在线设计 ISH 探针19,并查看设计算法的建议,以列出要订购的带有 Cy3 标签的探针。
- 提前将杂交缓冲液在37°C孵育2小时。
- 将 4 个光密度 (OD) 探针溶解在 160 μL 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的 ddH2O 中,浓度为 1 mg/mL,远离光。
注:光密度(OD)代表DNA和RNA的测量单位。通常,1 OD 单位 = 33 μg/mL DNA。 - 为每个孔准备200μL探针混合物(1.2μL-10μL探针,70μL杂交缓冲液,用DEPC处理的ddH 2O至200μL补足体积),并建立50μg/ mL,25μg/ mL,12.5μg/ mL和6μg/ mL的系列。
注意:探针浓度需要提前通过实验进行探索。高探针浓度会导致lncRNA的非特异性结合,而低探针浓度将导致lncRNA检测不灵敏或检测失败。 - 使探针混合物在73°C下变性5分钟。
注:如果Cy3标记的DNA探针是双链的,则在95°C下将探针变性为单链DNA,持续5分钟,然后在冰上快速冷却2分钟。
2. 细胞制备
- 在12孔细胞培养板中的无菌玻璃盖玻片上每孔接种50,000个143B细胞,并在DMEM中孵育24小时(37°C,5%CO2)。
注:此处接种的特定细胞数随细胞大小而变化,这适合于接种的细胞在孵育 24 小时后达到 50% 的汇合度。无菌玻璃盖玻片是圆形的,适用于 12 孔板。 - 取出培养基,用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2 x 5分钟。
注意:用DEPC处理的ddH2O准备1x PBS。在无RNase的条件下执行以下所有步骤。 - 取出1x PBS,并在每个孔中加入200μL的100%乙醇,在室温下固定15分钟。
- 除去乙醇,在每个孔中加入200μL0.1%Triton X-100(在1x PBS中),并在室温下孵育15分钟。
注意:时间需要用Triton X-100透化严格控制,不能太长。 - 除去0.1%Triton X-100,并用1x PBS洗涤2 x 5分钟。
注意:如果必须在此处暂停方案,请用70%乙醇替换PBS(用无RNase的ddH2O稀释100%乙醇),并将样品在4°C下储存长达3个月。 - 取出1x PBS,向每个孔中加入200μL2x盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液(用无RNase的ddH2O稀释20x SSC),并在37°C下孵育30分钟。
- 取出2x SSC缓冲液,向每个孔中加入200μL 70%乙醇,并在室温下孵育3分钟。
- 弃去70%乙醇,向每个孔中加入200μL85%乙醇(用不含RNase的ddH2O稀释100%乙醇),并在室温下孵育3分钟。
- 弃去85%乙醇,向每个孔中加入200μL100%乙醇,并在室温下孵育3分钟。
- 吸收并丢弃100%乙醇;让井干。
3. 荧光 原位 杂交(FISH)
- 向每个孔中加入200μL探针混合物(如步骤1.5所示变性),并在37°C下孵育过夜(16-18小时)。
注:杂交温度与探针浓度之间存在很强的正相关关系;因此,为了优化背景,应降低杂交温度和探针浓度。 - 第二天,从37°C取出样品并丢弃探针混合物。向每个孔中加入200μL的0.4x SSC / 0.3%吐温-20缓冲液(在65°C下预热),并在室温下洗涤2分钟。
- 取出0.4x SSC / 0.3%吐温-20缓冲液,向每个孔中加入200μL的2x SSC / 0.1%吐温-20缓冲液,并在室温下洗涤2分钟。
- 取出 2x SSC/0.1% 吐温-20 缓冲液,加入 200 μL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色溶液 (1 μg/mL),避光染色 20 分钟。
- 弃去DAPI染料溶液,在室温下用1x PBS洗涤2分钟。
- 将 50 μL 含有口香糖的封固剂加入载玻片上,并将玻璃盖玻片放在载玻片上进行固定。
注意:务必将盖玻片放在载玻片上,细胞面朝下。 - 在荧光显微镜下观察。
注意:使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜;后者产生更高的灵敏度和清晰度成像。
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Representative Results
显示了人骨肉瘤细胞中SNHG6 FISH的代表性图像(图2)。阴性对照用阴性Ctrl探针处理;阳性对照用U6探针 20处理。SNHG6探针和U6探针用Cy3标记,Cy3发出红色荧光。DAPI是一种染料,可对DNA进行染色,从而发出蓝色荧光。这一结果表明,SNHG6主要定位于细胞质中,这些信息可为SNHG6的进一步研究提供重要方向。
如果使用非常高浓度的探针,则可以在荧光显微镜下看到背景颜色。 图 3 显示了在 RNA FISH 中使用高浓度 SNHG6 探针时的代表性图像。白色箭头代表非特异性染色。
图 1:lncRNA 的 RNA FISH 方案流程图。该图表显示了RNA FISH实验过程的关键方案。缩写:FISH=荧光原位杂交;lncRNA = 长链非编码 RNA。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:LncRNA (SNHG6) 在人骨肉瘤细胞中的定位 (143B)。 阴性对照用阴性对照探针处理。阳性对照用 U6 探针处理。 SNHG6 和 U6 探针用 Cy3 标记,Cy3 发出红色荧光。DAPI是一种染料,可对DNA进行染色并发出蓝色荧光。红色和蓝色合并成粉红色。使用荧光显微镜拍摄图像。比例尺 = 10 μm。 缩写:LncRNA = 长链非编码 RNA;DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:RNA FISH 中高浓度 SNHG6 探针的代表性图像。 SNHG6 探针用Cy3标记,Cy3发出红色荧光。DAPI是一种染料,可对DNA进行染色并发出蓝色荧光。红色和蓝色合并成粉红色。使用荧光显微镜拍摄图像。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1:RNA FISH杂交实验中使用的溶液组成。 所有稀释都应使用无菌、无 RNase 的水进行。所有添加的水均经过 DEPC 处理的 ddH2O。 缩写:FISH = 荧光 原位 杂交;DEPC = 焦碳酸二乙酯。 请按此下载此表格。
表2:本实验中使用的所有探针序列。请按此下载此表格。
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Discussion
该RNA FISH方案不仅可以检测lncRNA在细胞中的定位,还可以检测细胞中其他RNA、DNA或蛋白质的共定位,也可用于检测lncRNA在石蜡包埋组织中的位置。然而,在这种情况下的具体方案是不同的,因为石蜡包埋的组织需要脱蜡21。该实验程序可应用于 48 孔或 96 孔板,但 384 孔板太小,无法在此处使用。
需要注意该方法的几个关键步骤,包括无RNase环境、探针浓度、杂交温度以及阴性和阳性对照的设置。首先,无RNase条件至关重要,因为RNase会破坏核苷酸之间的键,并导致lncRNA的降解。其次,通常推荐的探针浓度范围为 5 至 50 μg/mL。高探针浓度会导致 lncRNA 的非特异性结合,而低探针浓度会导致 lncRNA 检测不灵敏或检测失败 19。如果使用非常高浓度的探针,即使在仅存在加扰探针(阴性对照)的情况下,也可以在荧光显微镜下看到背景颜色;因此,在初步实验期间,通常使用相同浓度的阴性对照来建立基线(与内部对照相同),探索适当的探针浓度,以避免任何非特异性结合。在以下实验中使用阴性对照组中不含背景色的最高探针浓度,在没有非特异性结合的情况下呈现最强的信号转导。第三,建议设计至少两个或三个探针,用于特定lncRNA的优化。同时,还可以混合使用两个或多个探针,以提高靶向lncRNA的检测灵敏度。第四,lncRNA探针的正常杂交温度为37°C。 在杂交过程中,杂交温度应保持恒定和均匀。不同探针之间的杂交温度范围为 34 至 38 °C。 杂交温度与探针浓度呈强正相关;因此,为了优化背景,应降低探针浓度。最后,设置阴性和阳性对照也很重要。无探针组用作阴性对照以获得背景信号。 使用U6 探针或核糖体RNA探针作为阳性对照,以排除假阳性结果的可能性。
这种方法有几个优点。lncRNA探针的荧光颜色可以改变。异硫氰酸荧光素 (FITC)、荧光素 (FAM) 和 Alexa Fluor 488 发出绿色荧光,而 Cy3 和 Alexa Fluor 555 发出红色荧光。FITC 用于典型的绿色,Cy3 用于典型的红色。此外,还可以使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜获得图像。后者的图像比使用荧光显微镜获得的图像更灵敏、更清晰。
RNA FISH方法的局限性在于这是一种定性方法;因此,结果是不可量化的。由于杂交时间的变化和荧光显微镜观察过程中主观因素的影响,lncRNA在细胞中的表达无法准确定量。lncRNA在不同细胞组分中的表达水平只能定性评估。然而,随着技术的改进,已经开发了一种单分子荧光 原位 杂交 (smFISH) 方法22 来定量 RNA 表达水平;未来可能会报道更多的smFISH检测。
RNA FISH技术具有广泛的应用。lncRNA的细胞内定位检测有利于lncRNAs生物学机制的研究。同时,该技术还可用于检测细胞中其他非编码RNA的定位,包括circRNA、miRNA和tRNA。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了(1)中国国家重点研发计划(2020YFE0201600)的资助;(2)国家自然科学基金(81973877 82174408);(3)上海市医院中药制剂产业转化协同创新中心;(4)上海中医药大学预算内研究项目(2021LK047)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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