Экспресс-цитотоксичность рецептора химерного антигена Jurkat in vitro с использованием флуоресцентной визуализации
Summary
Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.
Abstract
Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) находятся на переднем крае онкологии. CAR состоит из целевого домена (обычно фрагмента переменной цепи, scFv) с сопутствующим внутрицепочечным линкером, за которым следуют шарнирный, трансмембранный и костимулирующий домены. Модификация внутрицепочечного линкера и шарнирного домена может оказать существенное влияние на CAR-опосредованное убийство. Принимая во внимание множество различных вариантов для каждой части конструкции CAR, существует большое количество перестановок. Изготовление CAR-T-клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом, а изготовление и тестирование многих конструкций требует больших временных и материальных затрат. Этот протокол описывает платформу для быстрой оценки шарнирно-оптимизированных конструкций CAR в ячейках Jurkat (CAR-J). Клетки Jurkat представляют собой иммортализированную линию Т-клеток с высоким поглощением лентивируса, что обеспечивает эффективную трансдукцию CAR. Здесь мы представляем платформу для быстрой оценки CAR-J с помощью флуоресцентного тепловизора с последующим подтверждением цитолиза в Т-клетках, полученных из PBMC.
Introduction
По даннымНационального института рака, с 2017 года CAR-T-клеточная терапия показала большие перспективы при гематологических злокачественных новообразованиях, о чем свидетельствуют 6 одобренных FDA продуктов CAR-T. Существует множество CAR-T-клеток, проводимых в клинических испытаниях для воздействия на солидные опухоли. Разработка новых мишеней для CAR и оптимизация конструкции CAR имеют жизненно важное значение для эффективности CAR-T-клеток. Выбор идеальной конструкции CAR для каждого применения имеет важное значение для точного нацеливания на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА) при одновременном избежании низких уровней экспрессии ТАА в нормальных тканях2.
Конструкция CAR в основном состоит из пяти компартментов: (1) внеклеточный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), нацеленный на опухолевой антиген; (2) шарнирный домен; (3) трансмембранный домен; (4) внутриклеточный цитоплазматический Т-клеточный костимулирующий домен; и (5) сигнальная область. Модификация каждого из этих доменов влияет на точность взаимодействия CAR-T-клетки со своей клеткой-мишенью3. Следовательно, оценка цитотоксичности и перекрестной реактивности этих CAR-конструкций in vitro имеет решающее значение для выбора правильной конструкции для перехода к экспериментам in vivo. Современные методы оценки цитолиза Т-клетками включают анализ высвобождения 51Cr, анализ высвобождения лактатдегидрогеназы, анализ биолюминесцентной визуализации, анализ клеток на основе импеданса в реальном времени и анализ проточной цитометрии на основе клеток 4,5. Описанная здесь платформа, основанная на флуоресцентной визуализации, идентифицирует количество живых и мертвых клеток, что является прямой количественной оценкой цитолиза Т-клеток, в отличие от косвенного метода оценки цитолиза Т-клетками.
Вот простой, экономичный, быстрый и высокопроизводительный метод с минимальным вмешательством для оценки цитотоксичности клеток Jurkat, экспрессирующих рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) CAR, против клеток трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) MDA-MB-231, а EGFR CRISPR нокаутирует клетки MDA-MB-231. Клетки Jurkat представляют собой иммортализированные Т-лимфоцитарные клеткичеловека 6, которые широко используются для изучения активации Т-клеток и сигнальных механизмов7. Кроме того, клетки Jurkat использовались для тестирования in vitro CAR в нескольких исследованиях 8,9,10,11. Клетки Jurkat легко трансдуцируются лентивирусом и имеют устойчивую пролиферацию, и эта система была использована для оптимизации шарнирного домена различных конструкций EGFR CAR.
Этот анализ может быть использован для скрининга нескольких конструкций CAR, нацеленных на различные опухолевые антигены, и использоваться против нескольких адгезивных линий опухолевых клеток и в различных соотношениях эффекторов и опухолей (E:T). Кроме того, можно оценить несколько временных точек и изменить количество репликаций, чтобы определить лучшее убийство среди различных конструкций CAR. Наилучшие конструкции должны быть подтверждены с использованием CD3 Т-клеток, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Общая цель разработки этого метода заключается в быстрой оптимизации геометрии шарнира CAR с высокой пропускной способностью, преодолевая такие барьеры, как низкая эффективность трансдукции, с последующим подтверждением на Т-клетках, полученных из PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предложен экспресс-метод оценки таргет-специфической цитолитической активности, индуцированной экспрессией CAR в клетках Jurkat. Все конструкции CAR имеют один и тот же scFv, но разные шарнирные и трансмембранные домены, которые, как было показано, влияют на активность CAR-T-клеток13…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 были любезным подарком от доктора Шейна Стеклайна. Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Онкологического центра Университета Канзаса для проведения этого исследования.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
