Summary
Ett analytiskt arbetsflöde baserat på vätskekromatografi, spektrometri för fångad jonrörlighet och time-of-flight-masspektrometri (LC-TIMS-ToF MS/MS) för hög konfidens och mycket reproducerbar "bottom-up"-analys av histonmodifieringar och identifiering baserat på huvudparametrar (retentionstid [RT], kollisionstvärsnitt [CCS] och exakt massa-till-laddningsförhållande [m/z]).
Abstract
Histonproteiner är mycket vanliga och bevarade bland eukaryoter och spelar en stor roll i genreglering som ett resultat av strukturer som kallas posttranslationella modifieringar (PTM). Genom att identifiera positionen och arten av varje PTM eller mönster av PTM med hänvisning till externa eller genetiska faktorer kan denna information vara statistiskt korrelerad med biologiska svar såsom DNA-transkription, replikation eller reparation. I detta arbete beskrivs ett analysprotokoll med hög kapacitet för detektion av histon-PTM från biologiska prover. Användningen av komplementär vätskekromatografi, spektrometri med fångad jonrörlighet och time-of-flight-masspektrometri (LC-TIMS-ToF MS/MS) möjliggör separation och PTM-tilldelning av de mest biologiskt relevanta modifieringarna i en enda analys. Det beskrivna tillvägagångssättet drar nytta av den senaste utvecklingen inom beroende datainsamling (DDA) med hjälp av parallell ackumulering i mobilitetsfällan, följt av sekventiell fragmentering och kollisionsinducerad dissociation. Histone PTM:er tilldelas med säkerhet baserat på deras retentionstid, rörlighet och fragmenteringsmönster.
Introduction
I eukaryota celler förpackas DNA som kromatin i funktionella enheter som kallas nukleosomer. Dessa enheter består av en oktamer av fyra kärnhistoner (två vardera av H2A, H2B, H3 och H4)1,2,3,4. Histoner är bland de vanligaste och mest bevarade proteinerna i eukaryoter, som till stor del är ansvariga för genreglering5. Histonposttranslationella modifieringar (PTM) spelar en stor roll i regleringen av kromatindynamiken och riggar olika biologiska processer såsom DNA-transkription, replikation och reparation6. PTM förekommer främst på den tillgängliga ytan av de N-terminala regionerna av histoner som är i kontakt med DNA 3,7. Modifieringar av svans och kärna påverkar dock kromatinstrukturen, förändrar interaktioner mellan nukleosomer och rekryterar specifika proteiner 3,8.
En aktuell utmaning inom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS)-baserad proteomik är den potentiella samelueringen av analyter av intresse. När det gäller databeroende analyser innebär detta en potentiell förlust av flera prekursorjoner under förvärvsprocessen mellan medlemsstaterna och medlemsstaterna9. Flygtidsinstrument (ToF) samlar in spektra vid mycket hög frekvens 9,10 (upp till tiotals kHz)11. Detta gör dem kapabla att snabbt skanna de totala prekursorjonerna i ett komplext prov (MS1), vilket lovar optimal känslighet och MS/MS-sekvenseringshastigheter (upp till 100 Hz)9 och gör dem idealiska för biologisk provanalys10. Den känslighet som är tillgänglig vid dessa höga skanningshastigheter begränsas dock av MS/MS-frekvensen9. Tillägget av TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry) i kombination med en ortogonal kvadrupol time-of-flight (qToF) masspektrometer användes för att mildra dessa begränsningar. I TIMS ackumuleras alla prekursorjoner i tandem och elueras som en funktion av deras rörlighet, snarare än att välja enskilda prekursormassor med en kvadrupol9. Parallell ackumulering-seriell fragmentering (PASEF) möjliggör hundratals MS/MS-händelser per sekund utan förlust av känslighet9.
Huvudsyftet med detta arbete var att visa den senaste utvecklingen av DDA med hjälp av parallell ackumulering i mobilitetsfällan följt av sekventiell fragmentering och kollisionsinducerad dissociation (CID). Histone PTM:er tilldelades med säkerhet baserat på deras retentionstider (RT), mobilitet och fragmenteringsmönster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Histonprover extraherades med en metod anpassad från Bhanu et al. (2020)12.
1. Beredning av prover
- Skörd av odlade celler
- När cellerna är 80 % sammanflytande, se till att de är livskraftiga med hjälp av trypanblå uteslutning.
OBS: En HeLa S3-cellinje användes för dessa experiment, men denna metod kan tillämpas på alla odlade celler. - Aspirera mediet och applicera sedan 5 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) på varje platta.
- Snurra plattan/plattorna för att skölja alla kvarvarande medier, aspirera sedan PBS och applicera 5 ml 1x PBS.
- Separera försiktigt cellerna från plattan genom att skrapa dem med en engångscelllyftare.
- Överför varje cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 800 x g i 5 min.
- Aspirera PBS från cellpelleten.
- Fortsätt till histonextraktion.
OBS: Snabbfrys cellpelleten i flytande kväve om den inte kan bearbetas omedelbart. Förvara pelletsen vid -80 °C tills det är klart.
- När cellerna är 80 % sammanflytande, se till att de är livskraftiga med hjälp av trypanblå uteslutning.
- Extraktion av histoner
- Uppskatta volymen av varje cellpellet och markera menisken med en permanent markör.
- Förbered tillräckligt med kärnisoleringsbuffert (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 och 250 mM sackaros) för alla prover. Alternativt, om många prover behöver bearbetas över tid, gör bufferten i bulk och lagra vid 2–8 °C i upp till 6 månader, eller alikvot och frys vid -15–25 °C på obestämd tid genom att endast tina upp den mängd som krävs för varje extraktion.
OBS: Bufferten ska vara fri under lagring. Om bufferten får ett grumligt eller på annat sätt onormalt utseende när som helst, kassera och förbered en ny buffert. - Bered 50 gånger volymen av cellpellets av tvättbuffert och tillsätt inhibitorer enligt följande (cirka 10 ml tvättbuffert per 2 prover).
- För att bereda 10 ml tvättbuffert, blanda 10 ml NIB, 30 μL 200 mM 4-(2-aminoetyl)bensensulfonylfluoridhydroklorid [AEBSF], 10 μL 1 M ditiotreitol [DTT], 20 μL 5 μM mikrocystin, 20 μL 5 M natriumbutyrat.
- Ta bort 1/5 av tvättbufferten för att förbereda lysbufferten (1/5 volym från tvättbufferten, 0,3 % NP-40 eller NP-40-alternativ).
OBS: Använd inte Triton-X 100 istället för NP-40 eller NP-40 alternativ, eftersom det kan vara för slipande för vissa celltyper. - Tvätta cellpelleten noggrant genom att hänga upp den i 5 kolonner tvättbuffert och centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C. Slutför detta steg två gånger, aspirera och kassera supernatanten mellan tvättarna.
- Se till att cellpelletsens volym fortfarande är markerad med en permanent markör. Återsuspendera i 10 volymer lysbuffert.
- Pipettera varje pellet noggrant för att återuppliva och inkubera sedan i 15 minuter på is.
- Efter 15 minuter centrifugerar du vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera och kasta bort supernatanten.
OBS: Pelleten bör minska till ≤ 1/2 av den ursprungliga pelletsstorleken (som indikeras av markeringslinjen). Om pelleten inte har reducerats tillräckligt, upprepa lyseringsproceduren och inkludera ett försiktigt homogeniseringssteg med en mortelstöt för att bryta upp cellerna. - När lyseringen är klar, återsuspendera pelleten i 500 μl tvättbuffert och centrifugera sedan vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera och kassera supernatanten, upprepa sedan tvättsteget en gång till för att ta bort alla spår av NP-40.
OBS: Vid denna tidpunkt består pelleten av kromatin, som innehåller histoner. - Återsuspendera pelleten i 5 volymer (av den ursprungliga cellpelletsstorleken) på 0,4 N H2SO4.
- Inkubera i 2 timmar i ett kallt rum eller kylskåp med hjälp av en omrörare.
- Efter 2 timmar centrifugeras proverna vid 3400 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kasta inte supernatanten.
- Överför supernatanten till nya rör och spetsa 100 % triklorättiksyra (TCA) till 1/3 av innehållets volym (den slutliga TCA-koncentrationen kommer att vara cirka 20 %).
- Vänd försiktigt upp och ner på röret och observera att den klara, färglösa lösningen blir vit och/eller grumlig, vilket indikerar proteinutfällning.
OBS: För lösningar med låga histonkoncentrationer kanske proteinutfällningen inte är omedelbart märkbar, men fällningen bör vara synlig efter inkubationen över natten. - Inkubera utan störningar över natten (12-18 timmar) vid 4 °C för att fälla ut histonproteinerna fullständigt.
- Följande dag, centrifugera vid 3400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten, var noga med att inte vidröra rörets sidor med pipettspetsen. I detta skede deponeras histonerna främst som en film runt rörets eller rörens sidor.
- Tillsätt 500 μL iskall aceton + 0,1 % HCl (sur aceton) till varje rör med hjälp av en pasteurpipett av glas och vänd sedan försiktigt upp och ner på röret/rören flera gånger. Ordna proverna i ordning (1, 2, 3, etc.) medan du gör detta, eftersom eventuell felaktig aceton kan ta bort markeringarna på rören. Centrifugera vid 3400 x g i 5 minuter vid 4 °C och dekantera försiktigt supernatanten.
- Upprepa detta sköljsteg med 500 μL iskall 100 % aceton, även med en Pasteur-pipett i glas. Centrifugera vid 3400 x g i 5 minuter vid 4 °C och dekantera försiktigt supernatanten.
- Låt rören vara öppna för att torka i rumstemperatur tills det återstående acetonet har avdunstat.
- När det är torrt, tillsätt 100 μL vatten av masspektrometri (MS) till varje rör. Använd denna droppe för att svabba alla sidor av behållaren för att återsuspendera hela histonfilmen. Gör detta genom att pipettera droppen på sidan av röret och rotera den medan du pipetterar upp och ner eller dispensera hälften av 100 μL och använda spetsen för att röra om runt den. En kombination av båda metoderna fungerar bäst. Hitoner är lättlösliga i vatten och kommer att finnas i lösningen.
- Efter att ha suspenderat alla prover, om det finns några återstående vita fasta ämnen, sonikera i ett bad vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför den klara lösningen till färska rör. Kassera eventuell kvarvarande olöslig pellet.
- Kör en SDS-PAGE under reducerande förhållanden för att verifiera att extraktionen är ren.
OBS: Geler kan köras med vilken lämplig koncentration av polyakrylamid som helst så länge den kan differentiera proteiner i intervallet 10-20 kDa. Se materialtabellen för de geler som används i detta protokoll. - Utför en proteinkoncentrationsanalys (dvs. Bradford eller BCA) för att bestämma den totala proteinkoncentrationen.
- Kemisk derivatisering (propionylering) av lysinresterna
- Överför 20 μg histoner (bestäms med hjälp av proteinanalysen) till ett rent rör. Torka provet ned till <5 μl med hjälp av en vakuumkoncentrator och återsuspendera sedan med 20 μl 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4CO3) (~ 1 μg/μl lösning). Justera pH till ~8 med ammoniumhydroxid om det behövs.
VARNING: Använd inte ammoniumhydroxid (NH4OH) för att återuppliva, bara för att justera pH vid behov. Annars kommer proteiner att denaturera och fällas ut.
OBS: För att kontrollera pH med minimal sample förlust, använd en pipettspets för att doppa i sample och dutta på en pH-remsa. Denna testprocedur kommer att vara användbar under de återstående provberedningsstegen. - Bered propionyleringsreagenset genom att tillsätta propionsyraanhydrid till acetonitril (ACN) i förhållandet 1:3 (v/v) (dvs. för att göra 40 μL reagens, kombinera 10 μL propionsyraanhydrid med 30 μL ACN).
OBS: Traditionellt har metanol eller isopropanol använts för att framställa ett propionyleringsreagens. Eftersom propionylering är en amidbildningsreaktion krävs ett icke-protoniskt lösningsmedel, som acetonitril, för att förhindra oönskade biverkningar och reaktioner, såsom metylpropionylester, som är resultatet av att använda metanol. Förbered endast tillräckligt med propionyleringsreagens för upp till 4 prover åt gången så att reagenset förblir färskt. Använd reagenset inom 1-2 minuter efter beredning. När reagenset sitter kommer propionsyraanhydriden att reagera med eventuell omgivande fukt, och ättiksyra kommer att börja bildas, vilket kan förändra reagensets effektivitet och kommer att ändra histonlösningens pH när reagenset har tillsatts. - Tillsätt propionyleringsreagens till varje prov i en 1:4 (v/v) (dvs. för 20 μl histoner, tillsätt 5 μL propionyleringsreagens).
- Tillsätt snabbt 1:5 (v/v) NH4OH (dvs. tillsätt 4 μL för 20 μL av histonlösningen) för att återställa lösningens pH till ~8. Om pH fortfarande är för lågt, tillsätt 1-2 μL NH4OH åt gången tills ett pH på 8 uppnås. Vanligtvis är ett förhållande på 1:5 (v/v) tillräckligt.
- Inkubera proverna i rumstemperatur i 15 minuter utan störningar.
- Upprepa propionyleringsreaktionen för högst 3-4 prover per sats propionyleringsreagens för att säkerställa minimal syrabildning.
- Upprepa förökningsproceduren steg 1.3.2-1.3.5. En andra omgång propionylering säkerställer att >95 % av tillgängliga lysiner derivatiseras.
- Torka proverna ner till <5 μl med hjälp av en vakuumkoncentrator. Detta kommer att avdunsta alla oreagerade propionyleringsreagens, sura produkter och ammoniakgas som frigörs från NH4OH. Om proverna torkar ut helt är detta bra, eftersom inga betydande provförluster uppstår.
OBS: Förskjut luft i propionsyraanhydridflaskan med argongas före förvaring för att förhindra bildning av ättiksyra på grund av kontakt med omgivande fukt som finns kvar i flaskan.
- Överför 20 μg histoner (bestäms med hjälp av proteinanalysen) till ett rent rör. Torka provet ned till <5 μl med hjälp av en vakuumkoncentrator och återsuspendera sedan med 20 μl 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4CO3) (~ 1 μg/μl lösning). Justera pH till ~8 med ammoniumhydroxid om det behövs.
- Proteolytisk nedbrytning med trypsin
- Återsuspendera histoner i 100 mM NH4HCO3 för att uppnå en volym på 20 μL och uppnå en optimal koncentration på 1 μg/μL.
OBS: Sample lösningar med koncentrationer lägre än 1 μg/μL kommer att resultera i minskad trypsineffektivitet. - Tillsätt trypsin till histonprover i förhållandet 1:10 (vikt/vikt) (dvs. tillsätt 2 μl 1 μg/μl trypsinlösning till 20 μg histoner).
- Inkubera reaktioner vid 37 °C i 6-8 timmar. Alternativt kan du inkubera över natten (12-18 timmar) i rumstemperatur.
- Stoppa matsmältningen genom att frysa vid -80 °C i minst 1 timme.
OBS: Använd inte syra för att släcka matsmältningsreaktionen, eftersom detta kommer att orsaka en oönskad sänkning av pH vid denna tidpunkt i proceduren. Provet kan förvaras vid -80 °C tills det är klart att fortsätta (tillfällig stopppunkt).
- Återsuspendera histoner i 100 mM NH4HCO3 för att uppnå en volym på 20 μL och uppnå en optimal koncentration på 1 μg/μL.
- Kemisk derivatisering (propionylering) av peptid N-terminaler
- Torka proverna till <5 μl med hjälp av en vakuumkoncentrator.
- Återsuspendera proverna upp till 20 μL (1 μg/μL) med 100 mM NH4HCO3.
- Upprepa propionyleringen som tidigare (steg 1.3).
OBS: Det är normalt att proverna tar längre tid att torka i detta steg på grund av ett högre vattenhaltigt: organiskt fasförhållande.
- Avsaltning av prover med stage-tips
- Återsuspendera eller späd prover med 50 μL MS-klassat vatten + 0,1 % TFA.
- Använd en 11-G provkärnare, stansa 5 skivor av C18-material från en fastfasextraktionsskiva (stansa alla 5 skivorna innan du överför till pipettspetsen). Sätt i och se till att skivorna är säkert och jämnt fastkilade i botten av en 200 μL pipettspets (Figur 1).
OBS: Använd 15-G kärna om du avsaltar över 25 μg sample genom en enda stage-spets. - Använd en centrifugadapter för att hålla stage-spetsarna på plats i 1.5 ml eller 2 ml mikrocentrifugrör.
OBS: För följande centrifugeringssteg, använd långsamt (400-500 x g) varv vid 4 °C, i 1-2 minuter åt gången; lösningsmedlen passerar normalt genom hartset på mindre än 1 minut, beroende på hur tätt C18-materialet är packat i spetsarna. - Skölj hartset genom centrifugering med 50 μL 100 % acetonitril för att aktivera C18-materialet och avlägsna potentiella föroreningar.
OBS: Det kan vara lättare att ladda lösningar på stage-spetsarna med hjälp av gelladdningspipettspetsar. När C18-materialet har aktiverats är det viktigt att inte låta hartset torka ut under avsaltningsproceduren. - Jämvikt skivmaterialet med 80 μL MS-vatten + 0,1 % TFA genom centrifugering.
- Surgör provet till pH 4 eller lägre med isättika. Kontrollera pH-värdet med pH-remsor som tidigare för att minimera provförlusten.
- Ladda hela provet på hartsskivan genom långsam centrifugering.
- Tvätta provet med 80 μl MS-vatten + 0,1 % TFA genom centrifugering.
- Eluera provet i ett rent 1,5 ml rör genom att spola 70 μl 75 % acetonitril och 0,5 % ättiksyra genom långsam centrifugering. Ytterligare centrifugeringstid kan användas för att säkerställa att hela provvolymen elueras från stegspetsen. Det är okej om hartset torkar ut med den extra centrifugeringstiden, eftersom det inte längre behövs efter elueringen av provet.
- Torka varje prov helt i en vakuumkoncentrator.
OBS: Sample(s) kan förvaras vid -80 °C tills de är redo att fortsätta (tillfällig stopppunkt). - För LC-MS/MS-analys, bered proverna i en volym lösningsmedel A (0,1 % myrsyra) från vätskekromatografiprotokollet (LC) som ger den slutliga koncentrationen på 0,4 μg/μl (dvs. lös 20 μg histoner i 50 μl lösningsmedel A).
2. Gränssnitt för TIMS-programvara
- Välj fliken Instrument och växla till Manövrera (kontrollera att instrumentnamnet markeras i grönt) (Figur 2).
- Kontrollera TIMS-parametrarna (figur 2).
- Kontrollera MS-inställningarna (skanning börjar, skanning slut, jonpolaritet, skanningsläge) (bild 2).
- Kontrollera TIMS-inställningarna (läge, mobilitetsstart, mobilitetsslut, ramptid, ackumuleringstid, arbetscykel, ramphastighet, MS-hastighet, MS-medelvärde och autokalibrering) (figur 2).
- Gå till fliken Källa och aktivera sprutalternativet (Hamilton 500 μL) endast för TuneMix-kalibreringssteget (Figur 3)13.
- Gå till fliken Kalibrering , klicka på m/z, välj Kalibreringsläge och välj läge (Enhanced Q, i allmänhet), zoom (+0.01%) STD Dev (0.24) och klicka på Kalibrera; När en poäng på 100 % har uppnåtts accepterar du (figur 4).
- Gå till mobilitetsfliken och upprepa kalibreringsprocessen (linjärt läge, i allmänhet), detektionsområde (+5%), bredd (0.1 Da), STD Dev (0.1855) och klicka sedan på kalibrera; när du får en poäng ≥ 98,5 % accepterar du (figur 5).
- Gå till metoden och välj den metod som ska användas; I det här exemplet har Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl valts (figur 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- Använd de typiska nESI-driftsförhållandena: 4500 V kapillärspänning, 800 V ändbricka offset, 3.0 bar nebulisatortryck, 10.0 L/min torr gas, 200 °C torr värmare och 50 μL/min insprutningsflöde.
- Använd de typiska MS-inställningarna: 6 eV kollisionsenergi, 1200 Vpp kollision RF, 75 μs överföringstid, 5 μs förpulslagring.
- Bestäm drivgasflödet med hjälp av tryckskillnaden mellan ingångstratten P1 och utloppstratten P2. Parallell ackumulering-seriell fragmentering (PASEF) sker i TIMS-cellen, vilket ackumulerar alla prekursorjoner samtidigt snarare än individuellt. Prekursorjoner frigörs sedan i smala jontoppar jämfört med de normalt mycket bredare topparna (cirka 50 gånger kortare), vilket ökar signal-brusförhållandet samtidigt som de separerar co-eluerande peptider via mobilitet14.
- Utveckla en LC-TIMS-ToF MS/MS-metod för analys av proteolytiska histonpeptider. Koppla ihop en högpresterande vätskekromatograf (HPLC) utrustad med en C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) kolonn med ett kommersiellt TIMS-TOF MS-instrument med proprietär PASEF-teknik.
OBS: Denna kolonnstorlek bestämdes för att ge god separation vid både högt och lågt pH för peptidblandningar, baserat på tidigare publicerade arbeten 15,16,17.- Ställ in injektionsvolymen på 20 μL (8 μg) sample och en flödeshastighet på 0.4 ml/min.
- Kör en 60-minuters icke-linjär LC-gradient med vatten med 0,1 % myrsyra (lösningsmedel A) och acetonitril med 0,1 % myrsyra (lösningsmedel B). Ställ in lutningen: 10 % B i 2,7 min, sedan till 20 % B på 5,3 min, 28 % B på 4 min, 35 % B på ytterligare 18 min, till 40 % B på 13 min och 100 % B på ytterligare 2 min. Efter att ha hållit 100 % B i 5 minuter, sänk koncentrationen till 10 % B i 5 minuter och håll kvar i de sista 5 minuterna.
- Verifiera provelueringen från HPLC till TIMS-TOF via nanoelektrosprayjonisering (nESI) i positivt joniseringsläge.
4. Analys av data
- Identifiera peptidsekvenser och modifieringsställen.
- Förbered en teoretisk lista över peptider med hjälp av ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-verktyget.
- Utför en teoretisk digest samtidigt som du tar hänsyn till förhållandena för digesten (enzym som används), typer av PTM som söks efter (t.ex. mono-, di- eller trimetylering), storleksintervallet för peptider som söks efter, samt massdetektionsområde och det potentiella antalet missade klyvningar.
- Förbered en teoretisk lista över peptider med hjälp av ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-verktyget.
- Manuellt analysera insamlad data baserat på teoretiska peptider (Figur 6)12.
- Sök efter massorna vid flera laddningstillstånd (+1 till +4) för varje teoretisk peptid söks.
- Efter den första identifieringen av varje m/z, välj toppen och bekräfta MS/MS med hjälp av en teoretisk lista över fragmenteringsjoner baserade på peptidsekvensen, inklusive PTM.
OBS: Om rörligheten hos den identifierade peptiden var känd tidigare är detta också bekräftat.
- Beräkna den relativa förekomsten av olika PTM och rapportera varje modifiering som en procentandel av den specificerade peptidsekvensen.
- Den relativa förekomsten av varje detekterad PTM beräknas med hjälp av följande ekvation:
Relativ abundans = Arean av PTM/Total arean av omodifierade och PTM för en given peptid
- Den relativa förekomsten av varje detekterad PTM beräknas med hjälp av följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett proteomikarbetsflöde nedifrån och upp (figur 7) omfattar vanligtvis följande: extraktion av målproteinet eller målproteinerna från ett råprov, följt av kvantifiering av koncentrationen av proteinet/proteinerna och sedan fraktionering, vanligtvis genom gelelektrofores eller vätskekromatografi. Efter fraktionering bryts proteinerna med hjälp av ett proteolytiskt enzym (ofta trypsin), och slutligen masspektrometrisk analys av de resulterande peptiderna och proteinidentifiering med hjälp av en etablerad databas18. Sekvensinformation härleds från prekursorjoner inom det angivna mass-till-laddningsområdet (m/z), som utsätts för kollisionsinducerad dissociation (CID), vilket ger fragmenteringsmönster som ska identifieras och sekvenseras med hjälp av en databas19 (figur 8).
För detta arbete var det huvudsakliga målet att utveckla och tillämpa en LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA-metod enligt de steg som beskrivits tidigare i protokollavsnittet. Att bestämma positionaliteten för posttranslationella modifieringar på isomera och isobariska peptider har inneburit en särskild utmaning när det gäller identifiering och spektrumtolkning. I denna studie användes rekombinanta humana histonstandarder och HeLa S3-celler som prover.
Histon-PTM-analys av humana histonstandarder via ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS gav medelstora till stora peptider (3-30 aminosyror långa) detekterade med så många som 5 laddningar per peptid. Propionyleringsproceduren var framgångsrik när det gällde att producera längre, mer informativa peptider än de som vanligtvis produceras av tryptisk matsmältning. Vid dataanalys identifierades peptider i olika modifierade tillstånd. En fördel är att den TIMS-baserade metoden differentierade vissa positionella isomera peptider som bär på samma PTM. Till exempel kan två isomera arter överlappa varandra i retentionstid och m/z; De två signalerna kan dock separeras på mobilitetsområdet (figur 9).
Motsvarande fragmenteringsspektra för peptiderna som visas i figur 9 annoterades med proteomikanalysprogramvara med hjälp av lämpliga FASTA-filer. I figur 9A ses den omodifierade peptiden med tre propionylgrupper (+56,03) (på N-terminalen, lysin 18 och lysin 23). I figur 9B observeras peptiden med en acetylgrupp (+42,02) på lysin 18 och två propionylgrupper (en vid N-terminalen och en på lysin 23). Slutligen, i figur 9C ses peptiden med en acetylering observerad på lysin 23 och två propionylgrupper (på N-terminalen och lysin 18). Som tidigare publicerats kan PASEF-fördelen användas för att öka sekvenseringshastigheten och känsligheten genom att rikta in sig på samma funktion upprepade gånger9. Detta gör det möjligt för användaren att få mer strukturell information från biologiska prover. I detta fall tillämpas detta på typen och positionen för PTM som förekommer på varje histon.
Posttranslationell modifieringsanalys kan också representeras visuellt som ett sekvenstäckningsdiagram, som visas i figur 10. I figur 10A har histon H3-standarden som har propionylerats före matsmältningen längre peptider än vad som annars skulle ha blivit resultatet, vilket betecknas med de blå linjerna. Histoner extraherade från HeLa S3-celler bearbetades på samma sätt, vilket representeras av figur 10B. Flera PTM indikerades, inklusive många olika mönster vid samma aminosyrapositioner. Detta kan förväntas av biologiska prover. Värt att notera är att de få grå linjerna i figur 10B betecknar peptider som identifierades tvetydigt på grund av avsaknaden av MS2 till följd av den låga intensiteten.
Figur 1: Schematisk representation och produktion av scenspetsar. (A-G) Steg-för-steg-guide för tillverkning av en C18-kiseldioxidskiva stage spets. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Databehandling: 20210804 propionylerade standardhistoner Mix_QC peptid. Innan du börjar bearbeta data, se till att förbereda den teoretiska listan över möjliga laddningstillstånd och deras fragmenteringar (1550.9013; 775.9543; 517.6386; etc.) för att extrahera dessa värden från bastoppkromatogrammet (BPC + All MS). Efter att ha extraherat varje peptid, se till att den ser ut som analyslistan som visas i figuren. Toppen 775,9543 valdes som exempel. På höger sida av figuren visas tre grafer: den första motsvarar kromatogrammet (intensitet kontra tidsgraf), den andra mobilogrammet och den tredje massspektrumet med PASEF-fragmentering inkluderad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: timsControl-protokoll steg 1-4. Figuren visar de fyra första stegen i timsControl-proceduren. Klicka på instrumentknappen uppe till vänster för att slå på och av anslutningen mellan instrumentet och programvaran. Innan man utför någon uppgift måste man se till att programvaran är i driftläge. Kontrollera slutligen att TIMS-parametrarna är korrekta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Källparametrar. I detta fall användes Syringe Hamilton 500 μL endast för TuneMix. Kontrollera att de andra parametrarna förblir korrekta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kalibrering av massa till laddning (m/z). Välj Kalibrera tills en poäng på 100 % har uppnåtts i kalibreringsläget i den nedre vänstra panelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kalibrering av rörlighet. Välj Kalibrera tills en poäng på minst 98.5 % har uppnåtts i kalibreringsläget i den nedre vänstra panelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 7: Typiskt arbetsflöde för proteomik nedifrån och upp. Steg-för-steg av bottom-up-förfarandena från provberedning till identifiering9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Retentionstid, isotopmönster och H3 18-26 mobilitetsprofiler. (A) Omodifierad propionylerad, (B) K23Ac-peptidpropionylerad i de andra två positionerna, och (C) K18Ac-propionylerad i de andra två positionerna. Lägg märke till fördelarna med mobilitetsseparationen för de strukturella isomererna som visas i panelerna B och C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Exempel på sekvensering av MS/MS-fragmenteringspeptider med PASEF. Fragmentspektra erhölls från proteomikanalysprogramvara för H3-peptiden med aminosyrapositionerna 18-26. (A) omodifierad propionylerad, (B) K23Ac peptidpropionylerad i de andra två positionerna, och (C) K18Ac-propionylerad i de andra två positionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 10: Exempel på en visuell sammanfattning av PTM-analys av histon. Resultat av observerade peptider och PTM från (A) en H3-standard och (B) H3 från HeLa S3-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Standard- och HeLa S3-peptid LC-TIMS-ToF MS/MS-egenskaper. Mål- och observerad peptidlista, inklusive experimentella egenskaper (dvs. retentionstid, m/z, 1/Ko och LC-toppareor). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hitoner är basiska proteiner som reglerar kromatinstrukturen genom att interagera med DNA i form av oktamerer som består av de fyra kärnhistonerna (två vardera av H2A, H2B, H3 och H4)20. Hitoner innehåller många lysin- och argininrester, som lätt modifieras, vilket leder till omfattande PTM som förändrar kromatinkemin genom att påverka histonfunktionen eller genom att binda till andra cellulära proteiner21. PTM kan framkalla biologiska reaktioner genom att arbeta tillsammans, med specifika grupper av PTM som har rapporterats i flera sjukdomar, framför allt flera typer av cancer22.
När DNA-skador upptäcks på cellulär nivå följs det omedelbart av en komplex signalkaskad där lesioner markeras, följt av samordning av cellcykelprogression och aktivering av de nödvändiga reparationsvägarna. Dessutom inducerar DNA-skador olika modifieringar, såsom acetyl- och metyladdukter, vilket underlättar proteinrekrytering23. Den stora variationen av PTM som är involverade i DNA-lesioner leder till frågan om hur dessa molekylära mekanismer reglerar deras samexistens och vilken funktionell betydelse det har att försvara genomets integritet genom ett extremt komplext integrerat nätverk. Till exempel har lysin 9-trimetylering av histon H3 (H3K9me3) kopplats till olika patologier vid olika sjukdomar24. Av skäl som denna är det nödvändigt att utveckla instrumentella analytiska metoder som möjliggör fullständig karakterisering av dessa modifieringar på cellulär nivå23.
Analys av HeLa S3-histonextraktioner med hjälp av programvara för manuell dataanalys och proteomikanalysprogramvara avslöjade PTM, inklusive acetylering (+42,01 Da), metylpropionylering (+70,04 Da), dimetylering (+28,03 Da) och trimetylering (+42,05) för flera histonproteiner. Dessutom kunde den PASEF-baserade MS/MS-metoden differentiera vissa positionella isomera peptider som bär på samma PTM.
I inledningen beskrivs kortfattat fördelarna med att koppla ihop LC-TIMS-ToF MS/MS i studien av PTM för att visa den senaste utvecklingen av DDA med parallell ackumulering i mobilitetsfällan följt av sekventiell fragmentering och kollisionsinducerad dissociation. Huvudtanken är att etablera en metodik som gör det möjligt att lösa upp signaler som kommer från olika peptider och som klassiska tekniker hittills inte har kunnat lösa. Derivatiseringsprocessen med propionsyraanhydrid förhindrar klyvning av lysin C-terminaler av trypsin, vilket genererar längre, mer informativa peptider. Peptider med samma m/z och retentionstid kunde identifieras genom deras fragmenteringsmönster, men man såg också att vissa av dessa arter kunde separeras i mobilitetsdomänen med hjälp av denna LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS-metod.
För att bättre förstå detta representerar figur 8 tre huvudegenskaper hos alla molekyler, vilket gör det möjligt att identifiera en förening, oavsett om de är intakta proteiner, lipider eller peptider (i detta fall histon H3 18-26), för att nämna några exempel. Dessa egenskaper inkluderar retentionstiden (min) för en förening i den kromatografiska kolonnen, massladdningsförhållandet (m/z) för varje förening och rörligheten (1/Ko) som dessa föreningar uppvisar när de interagerar med drivgasen. I figur 8A visas den omodifierade H3-peptiden 18-26 ha en RT på 28,15 min och att den uppvisar två band i sitt mobilitetsspektrum, vilket indikerar att den har minst två konformationer, ett resultat som misstänks vara ett resultat av de två lysiner (18 och 23) som har propionylerats enligt det tidigare beskrivna protokollet. Följande spektra (Figur 8B,C) visar samma peptid (H3 18-26) men varierande positionen för acetyleringsgruppen (42.02) mellan B, K18Ac och C, K23Ac. Dessa två isomerer (K18Ac och K23Ac) har identifierats genom mobilogrammet, eftersom de uppvisar olika rumsliga fördelningar, vilket resulterar i olika interaktioner med gasen i TIMS-cellen. Betydelsen av denna metod ligger i möjligheten att identifiera och studera mer i detalj de olika PTM som har associerats med olika sjukdomar genom till exempel DNA-skador.
När fragmenteringsdata är sparsamma är det svårt att identifiera en modifiering vid en specifik resthalt, eftersom två eller flera olikartade modifieringar kan inträffa samtidigt vid (eller nära) samma resthalter och kan förstås som en enda modifiering25. Detta kan lösas genom att säkerställa att den omodifierade peptiden har identifierats, särskilt genom att använda en standard för att bekräfta eller förneka förekomsten av en enda modifiering snarare än flera modifieringar (tabell 1).
För att undvika överdriven kontaminering eller extraktioner av orena histoner är det viktigt att kontrollera kvaliteten på reagenserna före användning. Om till exempel NIB-buffertlösningen lagras och används i bulk, se till att lösningen är klar utan att det yttre ser ut att vara grumligt eller onormalt. Grumlighet kan vara resultatet av bakterietillväxt, vilket skulle förorena prover och kan resultera i en blandning av histoner och bakterieproteiner. Dessutom rekommenderas det att förbereda nya kalibreringskurvor för analyser, såsom BCA- eller Bradford-analysen som används för att bestämma proteinkoncentrationen, för att säkerställa att proteinet som används för kalibreringskurvan inte har gått ut eller bryts ned.
Denna metod kan utvidgas till andra typer av celler eller organismer, till exempel myggor. När det gäller hela eller partiella organismer är det särskilt viktigt att välja ett lämpligt antal organismer för att säkerställa att den slutliga histonkoncentrationen är lämplig för analys.
Som en allmän riktlinje för underhåll av masspektrometer bör fronten rengöras med jämna mellanrum för att förhindra ansamling på instrumentet och kontaminering mellan körningarna. Denna rengöring bör inkludera gardinen, öppningsplattan och kvadrupolen efter behov.
I allmänhet, när en LC används, är det nödvändigt att överväga att förbereda nya mobila faser varje vecka med lösningsmedel av MS-kvalitet. Det är god praxis att ha dedikerade pipetter och glas för mobil faspreparering och att tömma LC-ledningarna när nya lösningar placeras i systemet. Skydd och separationskolonner bör vanligtvis bytas ut var 100-200:e injektion respektive 500-1500 injektion26. Var noga med att injicera blankprover före och efter att du har kört en sats prover. Om det finns ett stort antal prover inom en viss batch kan man också överväga att köra ett tomt ämne med olika intervall inom batchen.
Protokollet tillhandahåller ett PASEF-baserat DDA-arbetsflöde för detektion av histon-PTM och differentiering av isobariska och isomera arter baserat på jonrörlighet.
Detta protokoll kräver omfattande provberedning, och den totala experimentella provberedningstiden bör redovisas. I genomsnitt tar provberedningsprotokollet 2-3 arbetsdagar att slutföra. Dessutom kan skillnader mellan laboratorier och instrumentversioner påverka analysens totala känslighet.
Mycket få proteomikdataanalysprogram har ansetts vara lämpliga för användning vid analys av histoner via bottom-up-metoder utan manuell justering eller korrigering 27,28,29. Resultaten bör (åtminstone till en början) bekräftas med hjälp av manuell analys, vilket också är tidskrävande. Om analysprogramvara används bör den ha MS/MS-anteckningsfunktioner, som i allmänhet är lätta att bekräfta eller avvisa.
Det är också värt att nämna att det är omöjligt att separera isomerer genom masspektrometri om inte en TIMS-cell sätts in och rörlighetsvärden används. till exempel kan positionerna för histonmodifieringar bestämmas med hjälp av fragmenteringsmönster (PASEF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Melvin A. Park och Matthew Willetts är anställda av Bruker Daltonics Inc., tillverkaren av timsTOF-instrumentet.
Acknowledgments
Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under Grant No. HRD-1547798 och anslagsnummer. HRD-2111661. Dessa NSF-bidrag tilldelades Florida International University som en del av programmet Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Detta är bidrag nummer 1672 från Institute of Environment, ett framstående program vid Florida International University. Ytterligare stöd tillhandahölls av National Institute of Health inom ramen för anslag nr. R21AI135469 till Francisco Fernandez-Lima och Grant No. R01HD106051 till Benjamin A. Garcia, samt av National Science Foundation under anslagsnummer. CHE-2127882 till Benjamin A. Garcia. Författarna vill tacka Dr. Mario Gomez Hernandez för det initiala stödet under den inledande metodutvecklingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
