Verwendung von induzierbaren osteoblastischen Abstammungs-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Alveolarknochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegung
Summary
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Knochenumbaus unter kieferorthopädischer Kraft zur Verfügung und beschreibt Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegungen, wodurch ein Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts geworfen wird.
Abstract
Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Umsatzrate der am aktivsten umbauende Knochen im Körper. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM) ist ein gängiger künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung, aber der zugrunde liegende Mechanismus bleibt schwer fassbar. Bisherige Studien waren aufgrund von Einschränkungen im Tiermodell nicht in der Lage, den genauen Mechanismus des Knochenumbaus zu jeder Zeit und in jedem Raum aufzudecken. Der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist wichtig für den Knochenstoffwechsel, aber seine Rolle in Osteoblasten während der OTM ist unklar. Um in vivo den Nachweis zu erbringen, dass STAT3 zu bestimmten Zeitpunkten und in bestimmten Zellen während der OTM an der OTM beteiligt ist, haben wir ein Tamoxifen-induzierbares Osteoblastenlinien-spezifisches Stat3-Knockout-Mausmodell generiert, kieferorthopädische Kraft angewendet und den alveolären Knochenphänotyp analysiert.
Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und Stereomikroskopie wurden verwendet, um die OTM-Distanz zu erfassen. Die histologische Analyse wählte den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln des ersten Molaren (M1) im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) aus, um die metabolische Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten zu bewerten, was auf die Wirkung der kieferorthopädischen Kraft auf den Alveolarknochen hinweist. Kurz gesagt, wir stellen ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so ein neues Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts zu werfen.
Introduction
Es ist allgemein bekannt, dass Knochen während des gesamten Lebens als Reaktion auf mechanische Kräfte nach dem Wolffschen Gesetz 1,2 ständig rekonstruiert werden. Geeignete mechanische Stimulation, wie Schwerkraft und tägliche Bewegung, erhalten Knochenmasse und -stärke und beugen Knochenschwund vor, indem sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten stimuliert werden. Osteoklasten, die für den Knochenabbau verantwortlich sind 3,4,5,6,7, und Osteoblasten, die für die Knochenbildung verantwortlich sind 8,9,10, halten die Knochenhomöostase aufrecht und fungieren gemeinsam im biologischen Prozess des Knochenumbaus. Im Gegensatz dazu erleiden die Knochen in Abwesenheit von Belastungsreizen, wie bei Astronauten in der Langzeit-Schwerelosigkeit, einen Verlust der Knochenmineraldichte um 10 %, was das Risiko für Osteoporose erhöht11,12. Darüber hinaus haben sich nicht-invasive und bequeme mechanische Therapien, einschließlich Kieferorthopädie und Distraktionsosteogenese, als Behandlung von Knochenerkrankungen herauskristallisiert13,14. All dies hat gezeigt, dass mechanische Kraft eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Knochenqualität und -quantität spielt. Neuere Studien analysierten im Allgemeinen den Knochenumbau als Reaktion auf mechanische Belastung mit zeitaufwändigen Modellen wie Laufrad- und Heckaufhängungstests, die in der Regel 4 Wochen oder länger dauerten, um die Kraftbelastung oder -entlastung zu simulieren15,16. Daher besteht Bedarf an einem bequemen und effizienten Tiermodell für die Untersuchung des Knochenumbaus, der durch Kraftbelastung angetrieben wird.
Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Turnover-Rate am aktivsten in Bezug auf den Knochenumbau17. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM), eine gängige Behandlung von Zahnfehlstellungen, ist ein künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung. OTM, das einen schnellen Knochenumbau induziert18, ist jedoch auch eine zeitsparende Methode, um die Auswirkungen mechanischer Kraft auf den Knochenumbau im Vergleich zu anderen Modellen mit einer langen Versuchszeit zu untersuchen. Daher ist OTM ein ideales Modell, um den Knochenumbau unter mechanischen Stimuli zu untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass der Mechanismus des alveolären Knochenumbaus oft zeitkritisch ist und es notwendig ist, die Veränderungen des alveolären Knochenumbaus zu bestimmten Zeitpunkten nach der Modellierung zu beobachten. Mit den doppelten Vorteilen der zeitlichen und räumlichen Kontrolle der DNA-Rekombination und der Gewebespezifität ist ein induzierbares bedingtes Gen-Knockout-Mausmodell eine geeignete Wahl für OTM-Studien.
Konventionell wurde der OTM-vermittelte alveoläre Knochenumbau in Spannungszonen mit Knochenbildung und Druckzonen mit Knochenresorption unterteilt 19,20,21, was detaillierter, aber schwer zu regulieren ist. Darüber hinaus berichteten Yuri et al., dass sich der Zeitpunkt der Knochenbildung bei OTM auf der Zug- und Kompressionsseite unterschied22. Darüber hinaus hatte eine frühere Studie gezeigt, dass der erste Molar unter kieferorthopädischer Kraft, die nicht auf die Spannungs- und Druckzonen beschränkt war, einen breiten Umbau des Oberkieferalveolarknochens einleiten konnte23. Daher wählten wir den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) und beschrieben Methoden zur Bewertung der Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten im selben Bereich, um den alveolären Knochenumbau unter OTM zu bewerten.
Als nukleärer Transkriptionsfaktor hat sich der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) als entscheidend für die Knochenhomöostase erwiesen24,25. Frühere Studien berichteten über eine geringe Knochenmineraldichte und rezidivierende pathologische Frakturen bei Stat3-mutierten Mäusen26,27. Unsere frühere Studie zeigte, dass die Deletion von Stat3 de Osx+-Osteoblasten zu kraniofazialen Fehlbildungen und Osteoporose sowie zu spontanen Knochenbrüchen führte28. Kürzlich haben wir in vivo Beweise mit einem induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Deletions-Mausmodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, im Folgenden Stat3Col1α2ERT2) genannt), dass STAT3 entscheidend für die Vermittlung der Effekte der kieferorthopädischen Kraft ist, die den Umbau des Alveolarknochens antreibt29. In dieser Studie stellen wir Methoden und Protokolle für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenlinienspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so die mechanische Biologie des Skeletts zu beleuchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da Zahnfehlstellungen zu den häufigsten oralen Erkrankungen gehören, die die Atmung, das Kauen, das Sprechen und sogar das Aussehen beeinträchtigen, steigt die Nachfrage nach Kieferorthopädie von Tag zu Tag, wobei die Inzidenz laut einer früheren epidemiologischen Umfrage von 70 % auf 93 % steigt31,32. Wie der alveoläre Knochenumbau beschleunigt werden kann, um die Effizienz der kieferorthopädischen Behandlung sicher zu steigern, ist zu einem heißen Thema…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) unterstützt. die Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); das Programm des Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Klinischer Forschungsplan des SHDC (SHDC2020CR4084); der interdisziplinäre Forschungsfonds des Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); das Innovationsforschungsteam der High-Level Local Universities in Shanghai (SSMUZLCX20180501); Der Forschungsdisziplinfonds Nr. KQYJXK2020 vom Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine und College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Ursprüngliches Explorationsprojekt des Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Zweihundert-Talente-Projekt der Medizinischen Fakultät der Shanghai Jiao Tong Universität; das kooperative Forschungsprojekt des Instituts für Biomaterialien und regenerative Medizin Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); das Projekt der Biobank des Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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