유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구
Summary
본 연구는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하기 위한 프로토콜을 제공하고, 치아 교정 운동 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 실마리를 제공합니다.
Abstract
회전율이 높은 치조골은 신체에서 가장 활발하게 리모델링되는 뼈입니다. 치아 교정 운동(OTM)은 기계적 힘에 반응하여 치조골 뼈를 리모델링하는 일반적인 인위적인 과정이지만 근본적인 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 기존 연구들은 동물모델 관련 제약으로 인해 시간과 공간에 구애받지 않는 뼈 리모델링의 정확한 메커니즘을 밝힐 수 없었다. 전사 3의 신호 변환기 및 활성제(STAT3)는 뼈 대사에 중요하지만 OTM 중 조골세포에서 그 역할은 불분명합니다. STAT3가 특정 시점과 OTM 중 특정 세포에서 OTM에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해 타목시펜 유도 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 모델을 생성하고 교정력을 가하고 치조골 표현형을 분석했습니다.
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT)과 입체 현미경을 사용하여 OTM 거리에 접근했습니다. 조직학적 분석은 조골세포와 파골세포의 대사 활성을 평가하기 위해 상악골의 단면에서 첫 번째 대구치(M1)의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하여 치조골에 대한 교정력의 효과를 나타냅니다. 요컨대, 우리는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하고 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 새로운 빛을 비추는 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
일반적으로 뼈는 울프의 법칙 1,2에 따라 기계적 힘에 반응하여 일생 동안 지속적으로 재건되는 것으로 알려져 있습니다. 중력 및 일상적인 운동과 같은 적절한 기계적 자극은 골량과 강도를 유지하고 조골세포와 파골세포를 모두 자극하여 뼈 손실을 방지합니다. 골 흡수를 담당하는 파골세포(osteoclast)3,4,5,6,7와 골 형성을 담당하는 조골세포(osteoblast) 8,9,10은 뼈의 항상성을 유지하고 뼈 리모델링의 생물학적 과정에서 공동으로 기능합니다. 대조적으로, 장기간의 미세중력 하에서 우주비행사와 같이 하중 자극이 없는 경우, 뼈는 10%의 골밀도 손실을 겪고, 따라서 골다공증의 위험이 증가한다11,12. 또한, 교정 및 산만 골형성을 포함한 비침습적이고 편리한 기계 요법이 뼈 질환의 치료법으로 등장했습니다13,14. 이 모든 것은 기계적 힘이 뼈의 질과 양을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 최근 연구에서는 일반적으로 하중 하중 또는 하역을 시뮬레이션하는 데 일반적으로 4주 이상이 걸리는 러닝 휠 및 테일 서스펜션 테스트와 같은 시간 소모적인 모델을 사용하여 기계적 하중에 대한 반응으로 뼈 리모델링을 분석했습니다15,16. 따라서 힘 하중에 의한 뼈 리모델링을 연구하기 위한 편리하고 효율적인 동물 모델에 대한 수요가 있습니다.
치조골은 뼈 리모델링이 가장 활발하며, 회전율이 높다17. 부정교합에 대한 일반적인 치료법인 치아 교정 운동(OTM)은 기계적 힘에 반응하여 치조골 뼈를 인위적으로 리모델링하는 과정입니다. 그러나, 신속한 골 리모델링을 유도하는 OTM18은 실험 기간이 긴 다른 모델에 비해 뼈 리모델링에 대한 기계적 힘의 효과를 연구하는 시간을 절약할 수 있는 방법이기도 하다. 따라서 OTM은 기계적 자극 하에서 뼈 리모델링을 연구하는 데 이상적인 모델입니다. 치조골 리모델링의 메커니즘은 종종 시간에 민감하며, 모델링 후 특정 시점에서 치조골 리모델링의 변화를 관찰할 필요가 있다는 점은 주목할 만하다. DNA 재조합 및 조직 특이성의 시간적 및 공간적 제어라는 두 가지 장점이 있는 유도 가능한 조건부 유전자 녹아웃 마우스 모델은 OTM 연구에 적합한 선택입니다.
종래, OTM에 의한 치조골 리모델링은 뼈 형성을 수반하는 긴장 영역과 골 흡수를 수반하는 압력 영역으로 나뉘어 왔는데, 이는 더 상세하지만 조절하기 어렵다. 또한, Yuri et al.은 OTM에서 뼈 형성 시간이 장력 및 압박 측면에 따라 다르다고 보고했습니다22. 또한, 종전의 한 연구는 제1대구치가 장력 및 압력 영역(23)에 제약을 받지 않는 교정력 하에서 상악 치조골의 광범위한 리모델링을 시작할 수 있음을 입증하였다. 따라서 상악골의 단면에서 M1의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하고, OTM에서 치조골 리모델링을 평가하기 위해 동일한 영역에서 조골세포와 파골세포의 활성을 평가하는 방법을 설명했습니다.
핵 전사 인자로서, 전사 3의 신호 변환기 및 활성제(STAT3)는 뼈 항상성에서 중요한 것으로 입증되었습니다24,25. 이전 연구에서는 Stat3 돌연변이 마우스에서 낮은 골밀도와 재발성 병리학적 골절이 보고되었습니다26,27. 이전 연구에서는 Osx+ 조골세포에서 Stat3의 결실이 두개안면 기형과 골다공증, 자발적 골절을 유발한다는 것을 입증했다28. 최근에는 유도성 조골 세포 특이적 Stat3 결실 마우스 모델(Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, 이하 Stat3 Col1α2ERT2)는 STAT3가 치조골 리모델링을 유도하는 교정력의 효과를 매개하는 데 중요하다는 것을 의미한다29. 본 연구에서는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하는 방법과 프로토콜을 제공하고 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 실마리를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
부정교합은 호흡, 저작, 말하기, 심지어 외모를 손상시키는 가장 흔한 구강 장애 중 하나이기 때문에 이전 역학 조사에 따르면 발생률이 70%에서 93%로 증가하는 등 교정에 대한 수요가 나날이 증가하고 있습니다31,32. 치열 교정 치료의 효율성을 안전하게 높이기 위해 치조골 리모델링을 가속화하는 방법은 이 분야에서 뜨거운 주제가 되었습니다. 따라서 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 상하이 자연과학재단(21ZR1436900, 22ZR1436700); 상하이 학술/기술 연구 리더 프로그램(20XD1422300); SHDC의 임상 연구 계획(SHDC2020CR4084); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원의 학제간 연구 기금(JYJC201902, JYJC202116); 상하이 고급 지역 대학의 혁신 연구팀(SSMUZLCX20180501); 연구 규율 기금 no. KQYJXK2020 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 구강학 대학 출신; 상하이 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(JYYC003)의 독창적인 탐사 프로젝트; Shanghai Jiao Tong University School of Medicine의 200명의 인재 프로젝트; 생체 재료 및 재생 의학 연구소 협력 연구 프로젝트, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(2022LHB02); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원 바이오뱅크 프로젝트(YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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