Uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación del hueso alveolar durante el movimiento de los dientes de ortodoncia
Summary
Este estudio proporciona un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describe métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante el movimiento dental de ortodoncia, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.
Abstract
El hueso alveolar, con una alta tasa de recambio, es el hueso que más activamente remodela en el cuerpo. El movimiento dental ortodóncico (OTM) es un proceso artificial común de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica, pero el mecanismo subyacente sigue siendo difícil de alcanzar. Estudios anteriores no han podido revelar el mecanismo preciso de la remodelación ósea en ningún momento y espacio debido a las restricciones relacionadas con los modelos animales. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es importante en el metabolismo óseo, pero su papel en los osteoblastos durante la OTM no está claro. Para proporcionar evidencia in vivo de que STAT3 participa en OTM en puntos de tiempo específicos y en células particulares durante OTM, generamos un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible por tamoxifeno, aplicamos fuerza ortodóncica y analizamos el fenotipo óseo alveolar.
Se utilizó microtomografía computarizada (Micro-TC) y microscopía estereoscópica para acceder a la distancia OTM. El análisis histológico seleccionó el área ubicada dentro de tres raíces del primer molar (M1) en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) para evaluar la actividad metabólica de osteoblastos y osteoclastos, indicando el efecto de la fuerza ortodóncica sobre el hueso alveolar. En resumen, proporcionamos un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así nueva luz sobre la biología mecánica esquelética.
Introduction
Es generalmente conocido que el hueso está en constante reconstrucción a lo largo de la vida, en respuesta a fuerzas mecánicas de acuerdo con la ley de Wolff 1,2. La estimulación mecánica adecuada, como la gravedad y el ejercicio diario, mantiene la masa ósea y la fuerza y previene la pérdida ósea al estimular tanto los osteoblastos como los osteoclastos. Los osteoclastos, responsables de la resorción ósea 3,4,5,6,7, y los osteoblastos, responsables de la formación ósea 8,9,10, mantienen la homeostasis ósea y funcionan conjuntamente en el proceso biológico de remodelación ósea. Por el contrario, en ausencia de estímulos de carga, como en los astronautas sometidos a microgravedad a largo plazo, los huesos sufren una pérdida de densidad mineral ósea del 10%, aumentando así el riesgo de osteoporosis11,12. Además, las terapias mecánicas no invasivas y convenientes, como la ortodoncia y la osteogénesis por distracción, han surgido como tratamientos para las enfermedades óseas13,14. Todo esto ha demostrado que la fuerza mecánica juega un papel fundamental en el mantenimiento de la calidad y cantidad de los huesos. En general, estudios recientes analizaron la remodelación ósea en respuesta a la carga mecánica utilizando modelos que consumen mucho tiempo, como las pruebas de suspensión de la rueda y la cola, que generalmente tardaron 4 semanas o más en simular la carga o descarga forzada15,16. Por lo tanto, existe la demanda de un modelo animal conveniente y eficiente para estudiar la remodelación ósea impulsada por la carga de fuerza.
El hueso alveolar es el más activo en términos de remodelado óseo, con una alta tasa de recambio17. El movimiento dental ortodóncico (OTM), un tratamiento común para la maloclusión, es un proceso artificial de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica. Sin embargo, la OTM, que induce un rápido remodelado óseo18, es también una forma de ahorrar tiempo para estudiar los efectos de la fuerza mecánica sobre el remodelado óseo en comparación con otros modelos con un largo período experimental. Por lo tanto, la OTM es un modelo ideal para estudiar el remodelado óseo bajo estímulos mecánicos. Cabe destacar que el mecanismo de remodelación ósea alveolar suele ser sensible al tiempo, y es necesario observar los cambios en la remodelación ósea alveolar en ciertos momentos después del modelado. Con las ventajas duales del control temporal y espacial de la recombinación del ADN y la especificidad tisular, un modelo de ratón knockout de genes condicionales inducible es una opción adecuada para los estudios de OTM.
Convencionalmente, el remodelado óseo alveolar mediado por OTM se ha dividido en zonas de tensión que involucran la formación ósea y zonas de presión que involucran la resorción ósea 19,20,21, que es más detallada pero difícil de regular. Además, Yuri et al. reportaron que el tiempo de formación ósea en OTM difirió en los lados de tensión y compresión22. Además, un estudio previo había demostrado que el primer molar podía iniciar una amplia remodelación del hueso alveolar maxilar bajo la fuerza ortodóncica, que no estaba constreñida a las zonas de tensión y presión23. Por lo tanto, seleccionamos el área ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) y describimos métodos para evaluar la actividad de osteoblastos y osteoclastos en la misma área para evaluar el remodelado óseo alveolar bajo OTM.
Como factor de transcripción nuclear, el transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) ha demostrado ser crítico en la homeostasis ósea24,25. Estudios previos han reportado baja densidad mineral ósea y fracturas patológicas recurrentes en ratones con mutación Stat3 26,27. Nuestro estudio previo demostró que la deleción de Stat3 en osteoblastos Osx+ causaba malformación craneofacial y osteoporosis, así como fractura ósea espontánea28. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 específico de osteoblasto inducible (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, en lo sucesivo denominado Stat3Col1α2ERT2) que STAT3 es fundamental para mediar los efectos de la fuerza ortodóncica que impulsa la remodelación ósea alveolar29. En este estudio, proporcionamos métodos y protocolos para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dado que la maloclusión es uno de los trastornos bucales más comunes que afectan la respiración, la masticación, el habla e incluso la apariencia, la demanda de ortodoncia aumenta día a día, con una incidencia que aumenta del 70% al 93% según una encuesta epidemiológica previa31,32. Cómo acelerar la remodelación ósea alveolar para aumentar la eficiencia del tratamiento de ortodoncia de forma segura se ha convertido en un tema candente en este campo; po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (21ZR1436900, 22ZR1436700); el Programa de Líder de Investigación Académica/Tecnológica de Shanghái (20XD1422300); Plan de Investigación Clínica del SHDC (SHDC2020CR4084); el Fondo de Investigación Interdisciplinaria del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (JYJC201902, JYJC202116); el Equipo de Investigación en Innovación de las Universidades Locales de Alto Nivel de Shanghái (SSMUZLCX20180501); el Fondo de Disciplina de Investigación no. KQYJXK2020 del Noveno Hospital Popular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái y de la Facultad de Estomatología de la Universidad Jiao Tong de Shanghái; Proyecto de Exploración Original del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (JYYC003); Proyecto de Doscientos Talentos de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái; el Proyecto de Investigación Cooperativa del Instituto de Biomateriales y Medicina Regenerativa de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (2022LHB02); el Proyecto del Biobanco del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
References
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
