JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Het huidige protocol beschrijft een alomvattende strategie voor het evalueren van de farmacologische werking en het mechanisme van salidroside bij het remmen van de proliferatie en migratie van MCF-7-cellen.

Abstract

Salidroside (Sal) bevat anticarcinogene, antihypoxische en ontstekingsremmende farmacologische activiteiten. De onderliggende anti-borstkankermechanismen zijn echter slechts onvolledig opgehelderd. Vandaar dat dit protocol bedoeld was om het potentieel van Sal te decoderen bij het reguleren van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route in de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen van menselijke borstkanker. Ten eerste werd de farmacologische activiteit van Sal tegen MCF-7 geëvalueerd door middel van CCK-8- en celkrastesten. Bovendien werd de resistentie van MCF-7-cellen gemeten door middel van migratie- en Matrigel-invasietests. Voor celapoptose en cyclusassays werden MCF-7-cellen in stappen verwerkt met respectievelijk annexine V-FITC/PI en detectiekits voor celcycluskleuring voor flowcytometrieanalyses. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Ca2+ werden onderzocht door middel van DCFH-DA en Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring. De activiteiten van Na+-K+-ATPase en Ca2+-ATPase werden bepaald met behulp van de bijbehorende commerciële kits. De eiwit- en genexpressieniveaus in apoptose en de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route werden verder bepaald met behulp van respectievelijk western blot- en qRT-PCR-analyses. We ontdekten dat Sal-behandeling de proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen aanzienlijk beperkte, met dosisafhankelijke effecten. Ondertussen dwong de toediening van Sal MCF-7-cellen ook dramatisch om apoptose en celcyclusstilstand te ondergaan. De immunofluorescentietests toonden aan dat Sal de productie van ROS en Ca2+ in MCF-7-cellen waarneembaar stimuleerde. Verdere gegevens bevestigden dat Sal de expressieniveaus van pro-apoptotische eiwitten, Bax, Bim, gespleten caspase-9/7/3 en hun overeenkomstige genen bevorderde. Consequent verminderde Sal-interventie prominent de expressie van de Bcl-2-, p-PI3K/PI3K-, p-AKT/AKT-, mTOR-, HIF-1α- en FoxO1-eiwitten en hun overeenkomstige genen. Concluderend kan Sal worden gebruikt als een potentiële van kruiden afgeleide verbinding voor de behandeling van borstkanker, omdat het de kwaadaardige proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen kan verminderen door de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route te remmen.

Introduction

Als een van de meest gediagnosticeerde vormen van kanker en de meest voorkomende maligniteiten, geven de laatste statistieken aan dat er in 2020 wereldwijd 2,3 miljoen gevallen van borstkanker zijn ontstaan, goed voor 11,7% van alle gevallen vankanker1. Veel voorkomende symptomen van borstkanker zijn gevoelige en tintelingen in de borsten, knobbels en pijn in de borst, tepelafscheiding, erosie of ingevallen huid en vergrote oksellymfeklieren 1,2. Nog alarmerender is dat het aantal nieuwe gevallen en de totale incidentie van borstkanker elk jaar in een overweldigend tempo blijft toenemen, goed voor 6,9% van de kankergerelateerde sterfgevallen. Op dit moment bestaat de interventie bij borstkanker nog steeds voornamelijk uit chemotherapie, chirurgie, radiotherapie en uitgebreide behandeling. Hoewel behandeling het recidiefpercentage en het sterftecijfer van patiënten effectief kan verminderen, veroorzaakt langdurige behandeling vaak resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, haaruitval op grote oppervlakken, misselijkheid en braken, en ernstige mentale en psychologische belasting 2,3. Met name het potentiële risico op meerdere orgaanmetastasen van borstkanker dwingt mensen ook om nieuwe kruidenbronnen van medicamenteuze therapie te zoeken 4,5.

Fosfoinositide 3-kinase (PI3K)-gemedieerde signalering is betrokken bij de groei, proliferatie en overleving van borstkanker door middel van splicing die de expressie van meerdere genen beïnvloedt6. Als een stroomafwaarts signaalgevoelig eiwit van PI3K, suggereert talrijk bewijs dat eiwitkinase B (AKT) zou kunnen paren met het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) -eiwit om borstkanker verder te verhogen 7,8,9. Bovendien wordt beweerd dat de deactivering van PI3K/AKT/mTOR-signalering ook een sleutelcomponent is in geneesmiddelen die kwaadaardige proliferatie remmen en apoptose stimuleren bij borstkanker10,11,12. Het is bekend dat extreme hypoxie in de micro-omgeving van de tumor een enorme toename van hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α) veroorzaakt, wat de progressie van borstkanker verder verergert13,14,15. Tegelijkertijd leidt AKT-stimulatie ook tot overmatige accumulatie van HIF-1α, waardoor apoptose in borstkankermonsters wordt beperkt16,17. Interessant is dat is bevestigd dat de activering van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering betrokken is bij pathologische progressie en metastase bij verschillende vormen van kanker, waaronder longkanker18, colorectale kanker19, eierstokkanker20 en prostaatkanker21. Naast het feit dat het wordt georkestreerd door HIF-1α, wordt overexpressie van gevorkte hoofdtranscriptiefactor 1 (FoxO1) ook veroorzaakt door AKT-signaleringsstimulatie, die cyclusstilstand en remming van apoptose in borstkankercellen bevordert22,23. Samen suggereert het bovenstaande solide bewijs dat de remming van de cascade van PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering een potentieel nieuw doelwit kan zijn voor medicamenteuze behandeling bij borstkanker.

Van salidroside (Sal) is algemeen aangetoond dat het anti-kanker 24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 en immuunversterkende farmacologische activiteiten uitoefent 30. Het is een lichtbruin of bruin poeder dat gemakkelijk oplosbaar is in water, een soort fenylehanoïde glycoside is en een chemische structuurformule heeft van C14H 20 O7 en een molecuulgewicht van300,331,32. Modern farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat Sal de apoptose van maagkankercellen kan bevorderen door PI3K-AKT-mTOR-signalering te beperken24. Verder bewijs suggereert ook dat de onderdrukking van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering door Sal-behandeling kan bijdragen aan de apoptose van kankercellen door hun gevoeligheid voor chemotherapeutische middelen te vergroten25. Er zijn ook aanwijzingen dat Sal celmigratie en -invasie beperkt en cyclusstilstand veroorzaakt door apoptose te bevorderen in de MCF-7-cellen van borstkanker bij de mens33,34. Het valt echter nog te bezien of Sal de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan reguleren en de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen kan remmen. Daarom was dit protocol gericht op het onderzoeken van de effecten van Sal op MCF-7-celmigratie, invasie, celcyclus en apoptose via de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route. De geïntegreerde onderzoeksstrategieën die conventionele, goedkope en onafhankelijke experimenten omvatten, zoals celmigratie- en invasiebeoordelingen, apoptose en celcyclusdetectie door flowcytometrie, reactieve zuurstofspecies (ROS) en Ca2+ fluorescentiebepaling, enz., kunnen een referentie vormen voor het algemene ontwerp van experimenten voor antikankeronderzoek met traditionele kruidengeneeskunde. Het experimentele proces van deze studie is weergegeven in figuur 1.

Protocol

De MCF-7-cellen die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron (zie de materiaaltabel). 1. Celkweek Kweek de MCF-7-cellen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C met DMEM dat 10% FBS en 1% penicilline (10.000 E/ml)/streptomycine (10.000 μg/ml) bevat (zie de materiaaltabel).OPMERKING: De cellen die 90% van de bodem van de schaal bedekten, werden voor het experiment gebruikt en…

Representative Results

Effecten van Sal op het remmen van overmatige proliferatie en het vertragen van wondgenezing in MCF-7-cellenOm het potentieel van Sal tegen borstkanker te onderzoeken, hebben we eerst de kankerbestrijdende eigenschappen getest met behulp van celproliferatietoxiciteit en krastesten van de MCF-7-cellijn van borstkanker bij mensen. Deze cellen werden gedurende 24 uur gecoördineerd met een concentratiereeks van Sal (5-320 μM) en de celproliferatie werd geëvalueerd met behulp van een CCK-8-test. Er wer…

Discussion

Borstkanker treft mensen van alle leeftijden en veroorzaakt een onberekenbare fysieke en mentale belasting en grote economische druk1. Borstkanker, met zijn toenemende morbiditeit en mortaliteit elk jaar, heeft ook wereldwijd de aandacht getrokken in termen van het zoeken naar effectieve op kruiden gebaseerde samengestelde therapieën die verder gaan dan conventionele behandelingen 4,5. Veelbelovend is dat een grote hoeveelheid bewijs de a…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Sichuan (120025).

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Recherche en cancérologie. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Tags

Keywords: SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase
check_url/fr/65634?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image