MCF-7細胞の増殖と遊走を阻害するサリドロシドの薬理作用と分子機構の探索
Summary
現在のプロトコルはMCF-7セル拡散および移動の禁止のサリドロシドの薬理学の行為そしてメカニズムを評価するための広範囲の作戦を記述する。
Abstract
サリドロシド(Sal)には、抗発がん性、抗低酸素性、および抗炎症性の薬理活性が含まれています。.しかし、その根底にある抗乳がんメカニズムは不完全にしか解明されていません。それ故に、このプロトコルは人間の乳癌MCF-7セルの悪性増殖のPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道の調整のSalの潜在性を解読するように意図した。まず、MCF-7に対するSalの薬理活性をCCK-8および細胞スクラッチアッセイによって評価した。さらに、MCF-7細胞の耐性は、遊走およびマトリゲル浸潤アッセイによって測定されました。細胞アポトーシスおよびサイクルアッセイでは、MCF-7細胞をそれぞれアネキシンV-FITC/PIおよびフローサイトメトリー解析用の細胞周期染色検出キットを用いて段階的に処理しました。活性酸素種(ROS)およびCa2+のレベルをDCFH-DAおよびFluo-4 AM免疫蛍光染色によって調べました。Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-ATPaseの活性は、対応する市販キットを用いて測定した。アポトーシスおよびPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路におけるタンパク質および遺伝子発現レベルは、それぞれウェスタンブロットおよびqRT-PCR解析を用いてさらに決定された。Sal処理は、用量依存的な効果でMCF-7細胞の増殖、遊走、および浸潤を有意に制限することがわかりました。一方、サル投与は、MCF-7細胞を劇的にアポトーシスと細胞周期停止に追いやった。免疫蛍光試験では、SalがMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+産生を観察的に刺激することが示されました。さらなるデータにより、Salはアポトーシス促進性タンパク質であるBax、Bim、切断されたカスパーゼ-9/7/3、およびそれらに対応する遺伝子の発現レベルを促進することが確認されました。一貫して、Sal介入は、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、およびFoxO1タンパク質およびそれらに対応する遺伝子の発現を顕著に減少させた。結論として、Salは、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路を阻害することにより、MCF-7細胞の悪性増殖、遊走、および浸潤を減少させる可能性があるため、乳がんを治療するための潜在的なハーブ由来の化合物として使用できます。
Introduction
最も一般的に診断されるがんの1つであり、最も一般的な悪性腫瘍の1つである乳がんは、最新の統計によると、2020年までに世界中で230万例が発生し、全がん症例の11.7%を占めています1。乳がんの一般的な症状には、乳房の圧痛とうずき、乳房のしこりと痛み、乳頭の分泌物、びらんまたはくぼんだ皮膚、および腋窩リンパ節の肥大が含まれます1,2。さらに憂慮すべきことに、乳がんの新規患者数と全体的な発生率は毎年圧倒的な速度で増加し続けており、がん関連死の6.9%を占めています1。現在、乳がんの介入は、化学療法、手術、放射線療法、および包括的な治療が中心です。治療は患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができますが、長期治療の適用はしばしば多剤耐性、広範囲の脱毛、吐き気と嘔吐を引き起こし、深刻な精神的および心理的負担を引き起こします2,3。特に、乳がんによる多臓器転移の潜在的なリスクは、薬物療法の新しいハーブ源を探すことを人々に強いています4,5。
ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)を介したシグナル伝達は、複数の遺伝子の発現に影響を与えるスプライシングを介して、乳がんの増殖、増殖、および生存に関与しています6。PI3Kの下流シグナルセンシングタンパク質として、プロテインキナーゼB(AKT)が哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)タンパク質と結合して乳がんをさらに増加させる可能性があることを示唆する多くの証拠があります7,8,9。さらに、PI3K / AKT / mTORシグナル伝達の不活性化は、乳がんの悪性増殖を阻害し、アポトーシスを刺激する薬物の重要な要素であるとも主張されています10,11,12。腫瘍微小環境における極端な低酸素状態は、低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α)の大規模な急増を余儀なくされ、乳がんの進行をさらに悪化させることはよく知られています13,14,15。並行して、AKT刺激はHIF-1αの過剰蓄積にもつながり、乳がんサンプルのアポトーシスを制限します16,17。興味深いことに、PI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の活性化は、肺がん18、大腸がん19、卵巣がん20、前立腺がん21など、さまざまながんの病理学的進行と転移に関与していることが確認されています。HIF-1αによって調整されることに加えて、分岐頭部転写因子1(FoxO1)の過剰発現は、AKTシグナル伝達刺激によっても引き起こされ、乳がん細胞の周期停止とアポトーシスの阻害を促進します22,23。まとめると、上記の確かな証拠は、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達のカスケードの阻害が、乳がんにおける薬物療法の潜在的な新規標的である可能性があることを示唆しています。
サリドロシド(Sal)は、抗癌24,25、抗低酸素26,27,28,29、および免疫増強薬理活性30を発揮することが広く実証されています。水に溶けやすい薄茶色または褐色の粉末であり、フェニルエタノイド配糖体の一種であり、化学構造式はC14H 20 O7であり、分子量は300.331,32である。現代の薬理学的研究は、SalがPI3K-AKT-mTORシグナル伝達を抑制することにより、胃癌細胞のアポトーシスを促進することができることを実証している24。さらなる証拠はまた、Sal治療によるPI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の抑制が、化学療法剤に対する感受性を高めることによって癌細胞のアポトーシスに寄与する可能性があることを示唆しています25。証拠はまた、サルが細胞の移動と浸潤を制限し、ヒト乳がんMCF-7細胞のアポトーシスを促進することによって周期停止を引き起こすことを示唆しています33,34。しかし、SalがPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達を調節し、MCF-7細胞の悪性増殖を阻害できるかどうかは、まだ不明である。従って、このプロトコルはPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道によってMCF-7セル移動、浸潤、細胞周期およびapoptosisに対するSalの効果を探検することを向けた。細胞遊走や浸潤の評価、フローサイトメトリーによるアポトーシスや細胞周期の検出、活性酸素種(ROS)、Ca2+蛍光測定など、従来型の低コストで独立した実験からなる統合研究戦略は、従来の漢方薬を用いた抗がん研究の実験の全体的なデザインの参考となります。本研究の実験過程を図1に示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
乳がんはあらゆる年齢層に罹患し、計り知れない肉体的・精神的負担と大きな経済的圧力を引き起こします1。また、罹患率や死亡率が年々増加している乳がんは、従来の治療法を超えた効果的なハーブベースの複合療法の模索という点でも世界的に注目されています4,5。有望なことに、多くの証拠がSal 24,25,38<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、四川省衛生健康委員会(120025)の支援を受けました。
Materials
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Recherche en cancérologie. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
