Detta protokoll beskriver en omfattande strategi för att utvärdera den farmakologiska effekten och mekanismen för salidosid för att hämma MCF-7-cellproliferation och migration.
Salidrosid (Sal) innehåller anticancerframkallande, antihypoxiska och antiinflammatoriska farmakologiska aktiviteter. Dess underliggande mekanismer mot bröstcancer har dock bara klarlagts ofullständigt. Därför avsåg detta protokoll att avkoda Sals potential för att reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen i den maligna proliferationen av humana bröstcancer MCF-7-celler. Först utvärderades den farmakologiska aktiviteten av Sal mot MCF-7 med CCK-8 och cellskrapanalyser. Dessutom mättes resistensen hos MCF-7-celler genom migrations- och Matrigel-invasionsanalyser. För cellapoptos och cykelanalyser bearbetades MCF-7-celler i steg med annexin V-FITC/PI respektive cellcykelfärgningsdetektionskit för flödescytometrianalyser. Nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) och Ca2+ undersöktes med DCFH-DA och Fluo-4 AM immunofluorescensfärgning. Aktiviteterna för Na+-K+-ATPas och Ca2+-ATPas bestämdes med hjälp av motsvarande kommersiella kit. Protein- och genuttrycksnivåerna i apoptos och PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen bestämdes ytterligare med hjälp av western blot- respektive qRT-PCR-analyser. Vi fann att Sal-behandling signifikant begränsade proliferation, migration och invasion av MCF-7-celler med dosberoende effekter. Samtidigt tvingade Sal-administrationen också dramatiskt MCF-7-celler att genomgå apoptos och cellcykelstopp. Immunofluorescenstesterna visade att Sal observerbart stimulerade ROS- och Ca2+-produktionen i MCF-7-celler. Ytterligare data bekräftade att Sal främjade uttrycksnivåerna av pro-apoptotiska proteiner, Bax, Bim, klyvt kaspas-9/7/3 och deras motsvarande gener. Konsekvent minskade Sal-interventionen tydligt uttrycket av proteinerna Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α och FoxO1 och deras motsvarande gener. Sammanfattningsvis kan Sal användas som en potentiell örthärledd förening för behandling av bröstcancer, eftersom det kan minska den maligna proliferationen, migrationen och invasionen av MCF-7-celler genom att hämma PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen.
Som en av de vanligaste cancerdiagnoserna och de vanligaste maligniteterna visar den senaste statistiken att 2,3 miljoner fall av bröstcancer uppstod runt om i världen år 2020, vilket motsvarar 11,7 % av alla cancerfall1. Vanliga symtom på bröstcancer är ömhet och stickningar i brösten, knölar och smärta i bröstvårtorna, rinnande bröstvårtor, erosion eller insjunken hud samt förstorade lymfkörtlari armhålan 1,2. Ännu mer alarmerande är att antalet nya fall och den totala förekomsten av bröstcancer fortsätter att öka i en överväldigande takt varje år och står för 6,9 % av de cancerrelateradedödsfallen1. För närvarande omfattar bröstcancerintervention fortfarande främst kemoterapi, kirurgi, strålbehandling och omfattande behandling. Även om behandling effektivt kan minska återfallsfrekvensen och dödligheten hos patienter, orsakar långvarig behandlingstillämpning ofta multiresistens, håravfall på stora områden, illamående och kräkningar samt allvarlig mental och psykologisk börda 2,3. Den potentiella risken för multipla organmetastaser från bröstcancer tvingar också människor att söka nya växtbaserade källor för läkemedelsbehandling 4,5.
Fosfoinositid 3-kinas (PI3K)-medierad signalering är inblandad i tillväxt, proliferation och överlevnad av bröstcancer genom splitsning som påverkar uttrycket av flera gener6. Som ett nedströms signalavkännande protein av PI3K tyder många bevis på att proteinkinas B (AKT) kan kopplas till däggdjursmålet för rapamycin (mTOR) protein för att ytterligare öka bröstcancer 7,8,9. Dessutom har inaktiveringen av PI3K/AKT/mTOR-signalering också påståtts vara en nyckelkomponent i läkemedel som hämmar malign proliferation och stimulerar apoptos vid bröstcancer10,11,12. Det är välkänt att extrem hypoxi i tumörens mikromiljö tvingar fram en massiv ökning av hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α), vilket ytterligare förvärrar utvecklingen av bröstcancer13,14,15. Parallellt leder AKT-stimulering också till överdriven ackumulering av HIF-1α, vilket begränsar apoptos i bröstcancerprover16,17. Intressant nog har aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering bekräftats vara involverad i patologisk progression och metastasering i en mängd olika cancerformer, inklusive lungcancer18, kolorektal cancer19, äggstockscancer20 och prostatacancer21. Förutom att orkestreras av HIF-1α, utlöses överuttryck av transkriptionsfaktor 1 (FoxO1) med gaffelhuvud också av AKT-signalstimulering, vilket främjar cykelstopp och hämning av apoptos i bröstcancerceller22,23. Sammantaget tyder ovanstående solida bevis på att hämningen av kaskaden av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan vara ett potentiellt nytt mål för läkemedelsbehandling vid bröstcancer.
Salidroside (Sal) har i stor utsträckning visat sig utöva anti-cancer24,25, anti-hypoxi26,27,28,29 och immunstärkande farmakologiska aktiviteter30. Det är ett ljusbrunt eller brunt pulver som är lättlösligt i vatten, är en typ av fenyletanoidglykosid och har en kemisk strukturformel på C14H 20 O7 och en molekylvikt på300,331,32. Moderna farmakologiska undersökningar har visat att Sal kan främja apoptos av magcancerceller genom att begränsa PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Ytterligare bevis tyder också på att undertryckandet av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering genom Sal-behandling kan bidra till apoptos av cancerceller genom att öka deras känslighet för kemoterapeutiska medel25. Bevis tyder också på att Sal begränsar cellmigration och invasion och orsakar cykelstopp genom att främja apoptos i den humana bröstcancern MCF-7-celler33,34. Det återstår dock att se om Sal kan reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering och hämma den maligna proliferationen av MCF-7-celler. Därför syftade detta protokoll till att utforska effekterna av Sal på MCF-7-cellmigration, invasion, cellcykel och apoptos via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen. De integrerade forskningsstrategierna som omfattar konventionella, billiga och oberoende experiment, såsom cellmigration och invasionsbedömningar, apoptos och cellcykeldetektion genom flödescytometri, reaktiva syrearter (ROS) och Ca2+ fluorescensbestämning, etc., kan ge en referens för den övergripande utformningen av experiment för anti-cancerforskning med traditionell örtmedicin. Den experimentella processen för denna studie visas i figur 1.
Bröstcancer drabbar individer i alla åldrar och orsakar oöverskådlig fysisk och psykisk börda och stor ekonomisk press1. Bröstcancer, med dess ökande sjuklighet och dödlighet varje år, har också väckt uppmärksamhet över hela världen när det gäller att söka effektiva växtbaserade sammansatta terapier utöver konventionella behandlingar 4,5. Lovande nog har en stor mängd bevis avslöjat anti-cancereffekterna av Sal<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av hälsokommissionen i Sichuanprovinsen (120025).
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto | |
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |