Preparación y tinción por inmunofluorescencia de haces y células de fibra única de la corteza y el núcleo del cristalino del ojo
Summary
Este protocolo describe métodos para preparar células periféricas, maduras y nucleares de fibras del cristalino ocular para la tinción de inmunofluorescencia con el fin de estudiar las complejas interdigitaciones de célula a célula y la arquitectura de la membrana.
Abstract
El cristalino es un órgano transparente y elipsoide situado en la cámara anterior del ojo que cambia de forma para enfocar finamente la luz en la retina y formar una imagen clara. La mayor parte de este tejido está formado por células fibrosas especializadas y diferenciadas que tienen una sección transversal hexagonal y se extienden desde los polos anterior hasta el posterior del cristalino. Estas células largas y delgadas son muy opuestas a las células vecinas y tienen interdigitaciones complejas a lo largo de la célula. Las estructuras entrelazadas especializadas son necesarias para las propiedades biomecánicas normales de la lente y se han descrito ampliamente utilizando técnicas de microscopía electrónica. Este protocolo demuestra el primer método para preservar e inmunoteñir células de fibra de lente de ratón individuales y haces de células de fibra de lente de ratón para permitir la localización detallada de proteínas dentro de estas células de forma compleja. Los datos representativos muestran la tinción de las células de fibras periféricas, diferenciadoras, maduras y nucleares en todas las regiones del cristalino. Este método puede utilizarse potencialmente en células de fibra aisladas de lentes de otras especies.
Introduction
El cristalino es un tejido transparente y ovoide en la cámara anterior del ojo que está formado por dos tipos de células, epiteliales y fibrosas 1 (Figura 1). Existe una monocapa de células epiteliales que cubre el hemisferio anterior del cristalino. Las células fibrosas se diferencian de las células epiteliales y constituyen la mayor parte del cristalino. Las células fibrosas altamente especializadas experimentan una programación de elongación, diferenciación y maduración, marcada por cambios distintivos en la morfología de la membrana celular desde la periferia del cristalino hasta el centro del cristalino 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , también conocido como núcleo del cristalino. La función del cristalino para enfocar con precisión la luz que proviene de varias distancias sobre la retina depende de sus propiedades biomecánicas, incluida la rigidez y la elasticidad 13,14,15,16,17,18,19. Las complejas interdigitaciones de las fibras del cristalino han sido objeto de la hipótesis 20,21 y recientemente se ha demostrado que son importantes para la rigidez del cristalino 22,23.
Figura 1: Diagramas de anatomía del cristalino e imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido (SEM) de fibras del cristalino. La caricatura muestra una vista longitudinal (anterior a posterior, de arriba a abajo) de la monocapa anterior de células epiteliales (sombreada en azul claro) y una masa masiva de células de fibra del cristalino (blanca). El centro del cristalino (sombreado en rosa) se conoce como núcleo y está formado por células de fibra altamente compactadas. A la derecha, una caricatura de sección transversal revela la forma de celda hexagonal alargada de las fibras de la lente que están empaquetadas en un patrón de panal. Las células de fibra tienen dos lados anchos y cuatro lados cortos. Las imágenes SEM representativas a lo largo de la parte inferior muestran las complejas interdigitaciones de membrana entre las células de fibra de la lente a diferentes profundidades de la lente. Desde la derecha, las fibras recién formadas de la lente en la periferia de la lente tienen pequeñas protuberancias a lo largo de los lados cortos y bolas y zócalos a lo largo del lado ancho (cajas rojas). Durante la maduración, las fibras del cristalino desarrollan grandes dominios de paleta que están decorados por pequeñas protuberancias a lo largo de los lados cortos (cajas azules). Las células fibrosas maduras poseen grandes dominios de paleta ilustrados por pequeñas protuberancias. Estos dominios entrelazados son importantes para las propiedades biomecánicas del cristalino. Las células fibrosas en el núcleo del cristalino tienen menos protuberancias pequeñas a lo largo de sus lados cortos y tienen interdigitaciones machihembradas complejas (cajas moradas). Los lados anchos de la célula muestran una morfología de membrana globular. La caricatura fue modificada a partir de22,32 y no dibujada a escala. Barra de escala = 3 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El cristalino crece mediante la adición de capas de nuevas células de fibra superpuestas sobre las generaciones anteriores de fibras24,25. Las células de fibra tienen una forma de sección transversal hexagonal alargada con dos lados anchos y cuatro lados cortos. Estas células se extienden desde el polo anterior hasta el posterior del cristalino y, dependiendo de la especie, las fibras del cristalino pueden tener varios milímetros de longitud. Para apoyar la estructura de estas células alargadas y delgadas, las interdigitaciones especializadas a lo largo de los lados anchos y cortos crean estructuras entrelazadas para mantener la forma de la lente y las propiedades biomecánicas. Los cambios en la forma de la membrana celular durante la diferenciación y maduración de las células de fibra han sido ampliamente documentados por estudios de microscopía electrónica (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Las células de fibra recién formadas tienen bolas y alvéolos a lo largo de sus lados anchos con protuberancias muy pequeñas a lo largo de sus lados cortos, mientras que las fibras maduras tienen protuberancias entrelazadas y paletas a lo largo de sus lados cortos. Las fibras nucleares muestran interdigitaciones machihembradas y morfología de membrana globular. Poco se sabe sobre las proteínas que se requieren para estas complejas membranas entrelazadas. Estudios previos sobre la localización de proteínas en células de fibra se han basado en secciones de tejido del cristalino, que no permiten una visualización clara de la compleja arquitectura celular.
Este trabajo ha creado y perfeccionado un método novedoso para fijar células individuales y haces de fibras del cristalino para preservar la morfología compleja y permitir la inmunotinción de proteínas en la membrana celular y dentro del citoplasma. Este método preserva fielmente la arquitectura de la membrana celular, comparable a los datos de los estudios de EM, y permite la tinción con anticuerpos primarios para proteínas específicas. Hemos inmunoteñido previamente fibras corticales del cristalino en proceso de diferenciación y maduración22,23. En este protocolo, también hay un nuevo método para teñir células de fibra del núcleo del cristalino. Este protocolo abre la puerta a la comprensión de los mecanismos de formación y cambios en las interdigitaciones de la membrana durante la maduración de las células de fibra y la compactación del núcleo del cristalino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ha demostrado los métodos de fijación, preservación e inmunotinción que preservan fielmente la morfología de la membrana 3D de haces o células de fibra de lente singular de varias profundidades en el cristalino. Las fibras del cristalino teñidas se comparan con las preparaciones SEM que se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la morfología de las células de las fibras del cristalino. Los resultados muestran estructuras de membrana comparables entre ambas preparaciones. La EM sigue sien…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la subvención R01 EY032056 (a CC) del Instituto Nacional del Ojo. Los autores agradecen a la Dra. Theresa Fassel y Kimberly Vanderpool del Centro de Microscopía Central de Investigación Scripps por su ayuda con las imágenes de microscopio electrónico.
Materials
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
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