Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos
Summary
Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.
Abstract
Os hidrogéis fotosajustáveis podem transformar-se espacial e temporalmente em resposta à exposição à luz. A incorporação desses tipos de biomateriais em plataformas de cultura celular e o desencadeamento dinâmico de mudanças, como o aumento da rigidez microambiental, permite aos pesquisadores modelar as mudanças na matriz extracelular (MEC) que ocorrem durante a progressão da doença fibrótica. Neste trabalho, é apresentado um método para bioimpressão 3D de um biomaterial hidrogel fototável capaz de duas reações sequenciais de polimerização dentro de um banho suporte de gelatina. A técnica de bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) foi adaptada ajustando-se o pH do banho de suporte para facilitar uma reação de adição de Michael. Primeiro, a biotinta contendo poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) foi reagida fora da estequiometria com um reticulante degradável por células para formar hidrogéis moles. Esses hidrogéis moles foram posteriormente expostos ao fotoinibidor e à luz para induzir a homopolimerização dos grupos não reagidos e enrijecer o hidrogel. Este protocolo abrange síntese de hidrogel, bioimpressão 3D, fotoenrijecimento e caracterizações de desfechos para avaliar a ativação de fibroblastos em estruturas 3D. O método aqui apresentado permite aos pesquisadores bioimprimir em 3D uma variedade de materiais que sofrem reações de polimerização catalisadas por pH e pode ser implementado para projetar vários modelos de homeostase, doença e reparo tecidual.
Introduction
A bioimpressão 3D é uma tecnologia transformadora que permite aos pesquisadores depositar com precisão células e biomateriais em volumes 3D e recriar a complexa estrutura hierárquica dos tecidos biológicos. Na última década, avanços na bioimpressão 3D criaram tecidos cardíacos humanos batidos1, modelos funcionais de tecidos renais2, modelos de trocas gasosas dentro do pulmão3 e modelos tumorais para pesquisa de câncer4. A invenção de técnicas de bioimpressão 3D incorporadas, como a bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), tornou possível reproduzir estruturas complexas de tecidos moles, como vasos sanguíneos pulmonares5 e até coração humano6 em 3D. A bioimpressão 3D FRESH facilita a impressão camada por camada de biotintas macias e de baixa viscosidade através da extrusão em um banho de suporte de desbaste de cisalhamento. O banho de suporte consiste em um material como micropartículas de gelatina bem embaladas que atua como um plástico Bingham e mantém a forma e a estrutura pretendidas da biotinta após a impressão. Uma vez que a construção impressa tenha se solidificado, o banho de suporte pode então ser dissolvido aumentando a temperatura para 37 °C7.
Um artigo de revisão recente resumiu os materiais que foram bioimpressos em 3D em várias publicações usando a técnica FRESH. Esses materiais de origem natural variam desde colágeno tipo I até ácido hialurônico metacrilado e representam vários mecanismos diferentes de gelificação7. A maioria das pesquisas realizadas com essa técnica de bioimpressão 3D emprega biomateriais estáticos que não se alteram em resposta a estímulos externos. Biomateriais dinâmicos de hidrogel fotosajustáveis têm sido utilizados por nosso laboratório e outros 8,9,10,11,12 para modelar uma variedade de doenças fibróticas. Ao contrário dos biomateriais estáticos, as biotintas fotosajustáveis permitem que um modelo amolecido com menor valor de módulo de elasticidade seja criado e posteriormente enrijecido para explorar respostas celulares a aumentos no enrijecimento microambiental.
As doenças fibróticas caracterizam-se pelo aumento da produção de matriz extracelular, que pode causar cicatrizes e enrijecimento13. O enrijecimento tecidual pode iniciar novas lesões e destruição do tecido impactado, causando danos permanentes aos órgãos e até a morte; As desordens fibróticas são responsáveis por um terço da mortalidade mundial. Os fibroblastos produzem excesso e matriz extracelular aberrante nesse estadopatológico 14,15. O aumento da proliferação fibroblástica e a deposição de matriz extracelular enrijecem ainda mais o tecido e ativam uma alça de feedback positivo profibrótico16,17,18,19. O estudo da ativação de fibroblastos é vital para a compreensão das doenças fibróticas. Aqui apresentamos a hipertensão arterial pulmonar (HAP) humana como um exemplo de um distúrbio fibrótico no qual é importante imitar a geometria 3D do vaso sanguíneo usando bioimpressão 3D e introduzir as capacidades de enrijecimento dinâmico dos hidrogéis fotosajustáveis. A HAP é uma condição na qual a pressão nas artérias pulmonares principais ultrapassa os níveis normais e aplica tensão no coração, aumentando a ativação do fibroblasto adventício da artéria pulmonar humana (FAAPH) e enrijece os tecidos dos vasos sanguíneos16,17,18,19. Uma formulação de biotinta de poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) fototunable permite o enrijecimento temporal em construtos e ajuda a modelar tanto o tecido saudável quanto a progressão da doença 5,8,9,10. A exploração desta característica única permite a quantificação da ativação e proliferação de HPAAF em resposta ao enrijecimento microambiental em 3D e pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares envolvidos nesta doença. O protocolo aqui descrito permitirá aos pesquisadores criar modelos 3D que recapitulam mudanças no microambiente extracelular durante a progressão da doença ou reparo tecidual e estudar a ativação de fibroblastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reações de polimerização em duplo estágio em resposta à exposição controlada à luz podem enrijecer biomateriais com controle espacial e temporal. Vários estudos têm utilizado essa técnica para avaliar interações célula-matriz em diversas plataformas5,8,9,10,11,21,22,23.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e àqueles que organizaram o 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Esses indivíduos possibilitaram o aprendizado das técnicas de bioimpressão FRESH e a construção da bioimpressora 3D utilizada para esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Biorender.com, que foi usado para produzir figuras neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por vários grupos ou fontes de financiamento, incluindo a Rose Community Foundation (DDH e CMM), um Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), a National Science Foundation sob Award 1941401 (CMM), o Departamento do Exército sob o Prêmio W81XWH-20-1-0037 (CMM), o Instituto Nacional do Câncer do NIH sob o Prêmio R21 CA252172 (CMM), o Ludeman Family Center for Women’s Health Research da University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH e CMM), o National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os prêmios R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) e T32 HL072738 (DDH e AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
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