फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करने के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल
Summary
यह लेख बताता है कि बाह्य मैट्रिक्स कठोरता और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करने के लिए 3 डी बायोप्रिंट फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल कैसे करें।
Abstract
प्रकाश जोखिम के जवाब में फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल स्थानिक और अस्थायी रूप से बदल सकते हैं। सेल-कल्चर प्लेटफार्मों में इस प्रकार के बायोमैटेरियल्स को शामिल करना और गतिशील रूप से परिवर्तनों को ट्रिगर करना, जैसे कि माइक्रोएनवायरनमेंटल कठोरता में वृद्धि, शोधकर्ताओं को फाइब्रोटिक रोग की प्रगति के दौरान होने वाले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में परिवर्तन ों को मॉडल करने में सक्षम बनाता है। इसमें, जिलेटिन समर्थन स्नान के भीतर दो अनुक्रमिक पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाओं में सक्षम एक फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल बायोमटेरियल 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। निलंबित हाइड्रोगेल (फ्रेश) बायोप्रिंटिंग के फ्रीफॉर्म रिवर्सिबल एम्बेडिंग की तकनीक को माइकल अतिरिक्त प्रतिक्रिया की सुविधा के लिए समर्थन स्नान के पीएच को समायोजित करके अनुकूलित किया गया था। सबसे पहले, पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल)-अल्फा मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) युक्त बायोइंक को नरम हाइड्रोगेल बनाने के लिए सेल-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर के साथ ऑफ-स्टोइकोमेट्री पर प्रतिक्रिया दी गई थी। इन नरम हाइड्रोजेल को बाद में फोटोइनिटर और प्रकाश के संपर्क में लाया गया ताकि अप्रयुक्त समूहों के होमोपोलीमराइजेशन को प्रेरित किया जा सके और हाइड्रोगेल को कठोर किया जा सके। इस प्रोटोकॉल में 3 डी संरचनाओं के भीतर फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का आकलन करने के लिए हाइड्रोगेल संश्लेषण, 3 डी बायोप्रिंटिंग, फोटोस्टिकनिंग और एंडपॉइंट लक्षण वर्णन शामिल हैं। यहां प्रस्तुत विधि शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रकार की सामग्रियों को 3 डी बायोप्रिंट करने में सक्षम बनाती है जो पीएच-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाओं से गुजरती हैं और ऊतक होमियोस्टैसिस, बीमारी और मरम्मत के विभिन्न मॉडलों को इंजीनियर करने के लिए लागू की जा सकती हैं।
Introduction
3 डी बायोप्रिंटिंग एक परिवर्तनकारी तकनीक है जो शोधकर्ताओं को 3 डी वॉल्यूम के भीतर कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स को ठीक से जमा करने और जैविक ऊतकों की जटिल पदानुक्रमित संरचना को फिर से बनाने में सक्षम बनाती है। पिछले एक दशक में, 3 डी बायोप्रिंटिंग में प्रगति ने मानव हृदय के ऊतकों को हराया है1, गुर्दे के ऊतकों के कार्यात्मक मॉडल2, फेफड़े के भीतर गैस विनिमय के मॉडल3, और कैंसर अनुसंधान के लिए ट्यूमर मॉडल4। एम्बेडेड 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीकों के आविष्कार, जैसे कि फ्रीफॉर्म रिवर्सिबल एम्बेडिंग ऑफ सस्पेंडेड हाइड्रोगेल (फ्रेश) बायोप्रिंटिंग ने जटिल नरम ऊतक संरचनाओं जैसे फुफ्फुसीय रक्त वाहिकाओं5 और यहां तक कि मानव हृदय6 को 3 डी में पुन: पेश करना संभव बना दिया है। समर्थन स्नान में बारीकी से पैक किए गए जिलेटिन माइक्रोपार्टिकल्स जैसी सामग्री होती है जो बिंघम प्लास्टिक के रूप में कार्य करती है और मुद्रण के बाद बायोइंक के इच्छित आकार और संरचना को बनाए रखती है। एक बार जब मुद्रित निर्माण जम जाता है, तो समर्थन स्नान को 37डिग्री सेल्सियस तक तापमान बढ़ाकर भंग किया जा सकता है।
एक हालिया समीक्षा लेख ने उन सामग्रियों को संक्षेप में प्रस्तुत किया है जिन्हें फ्रेश तकनीक का उपयोग करके विभिन्न प्रकाशनों में 3 डी बायोप्रिंट किया गया है। ये स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न सामग्री कोलेजन टाइप 1 से लेकर मेथैक्रिलेटेड हाइलूरोनिक एसिड तक होती है और कई अलग-अलग गेलेशन तंत्रका प्रतिनिधित्व करती है। इस 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके किए गए अधिकांश शोध अध्ययन स्थैतिक बायोमैटेरियल्स को नियोजित करते हैं जो बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में नहीं बदलते हैं। डायनामिक फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स का उपयोग हमारी प्रयोगशाला और अन्य 8,9,10,11,12 द्वारा विभिन्न प्रकार के फाइब्रोटिक रोगों को मॉडल करने के लिए किया गया है। स्थैतिक बायोमैटेरियल्स के विपरीत, फोटोटेनेबल बायोइंक कम लोचदार मापांक मूल्य के साथ एक नरम मॉडल बनाने की अनुमति देते हैं और बाद में सूक्ष्म पर्यावरणीय कठोरता में वृद्धि के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए कठोर हो जाते हैं।
फाइब्रोोटिक रोगों को बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन में वृद्धि की विशेषता है जो निशान और कठोरता का कारण बन सकतीहै। ऊतक कठोरता प्रभावित ऊतक की आगे की चोट और विनाश शुरू कर सकती है, जिससे स्थायी अंग क्षति और यहां तक कि मृत्यु भी हो सकती है; फाइब्रोटिक विकार दुनिया भर में मृत्यु दर के एक तिहाई के लिए जिम्मेदार हैं। फाइब्रोब्लास्ट इस रोग अवस्था14,15 में अतिरिक्त और असामान्य बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं। बढ़े हुए फाइब्रोब्लास्ट प्रसार और बाह्य मैट्रिक्स जमाव ऊतक को और कठोर करते हैं और एक प्रोफिब्रोटिक सकारात्मक प्रतिक्रिया लूप 16,17,18,19 को सक्रिय करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन फाइब्रोोटिक रोगों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हम मानव फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) को एक फाइब्रोटिक विकार के उदाहरण के रूप में प्रस्तुत करते हैं जिसमें 3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग करके रक्त वाहिका की 3 डी ज्यामिति की नकल करना और फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल की गतिशील कठोरता क्षमताओं का परिचय देना महत्वपूर्ण है। पीएएच एक ऐसी स्थिति है जिसमें मुख्य फुफ्फुसीय धमनियों में दबाव सामान्य स्तर को पार कर जाता है और हृदय पर तनाव लागू करता है, जिससे मानव फुफ्फुसीय धमनी एडवेंटियल फाइब्रोब्लास्ट (एचपीएएएफ) सक्रियण बढ़ जाता है और रक्त वाहिका के ऊतकों 16,17,18,19 को कठोर कर देता है। एक फोटोटेनेबल पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल)-अल्फा मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) बायोइंक फॉर्मूलेशन संरचनाओं में अस्थायी कठोरता की अनुमति देता है और स्वस्थ ऊतक और रोग की प्रगति 5,8,9,10 दोनों को मॉडल करने में मदद करता है। इस अनूठी विशेषता का फायदा उठाने से 3 डी में सूक्ष्म पर्यावरणीय कठोरता के जवाब में एचपीएएएफ सक्रियण और प्रसार की मात्रा का ठहराव संभव हो सकता है और इस बीमारी में शामिल सेलुलर तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को 3 डी मॉडल बनाने की अनुमति देगा जो रोग की प्रगति या ऊतक की मरम्मत के दौरान बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन को पुन: उत्पन्न करता है और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नियंत्रित प्रकाश जोखिम के जवाब में दोहरे चरण के पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाएं स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के साथ बायोमैटेरियल्स को कठोर कर सकती हैं। कई अध्ययनों नेविभिन्न प्लेटफार्मों 5,8,9,10,11,21,22,2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एडम फीनबर्ग (कार्नेगी मेलन विश्वविद्यालय) और उन लोगों को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने 3 डी बायोप्रिंटिंग ओपन-सोर्स कार्यशाला की मेजबानी की। इन व्यक्तियों ने फ्रेश बायोप्रिंटिंग की तकनीकों को सीखना और इन अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 डी बायोप्रिंटर का निर्माण करना संभव बना दिया। इसके अतिरिक्त, लेखक Biorender.com को स्वीकार करना चाहते हैं, जिसका उपयोग इस पांडुलिपि में आंकड़े बनाने के लिए किया गया था। इस काम को कई समूहों या वित्त पोषण स्रोतों द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें रोज कम्युनिटी फाउंडेशन (डीडीएच और सीएमएम), कोलोराडो पल्मोनरी वैस्कुलर डिजीज रिसर्च अवार्ड (डीडीएच और सीएमएम), अवार्ड 1941401 (सीएमएम) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन, अवार्ड डब्ल्यू 81एक्सडब्ल्यूएच -20-1-0037 (सीएमएम) के तहत सेना विभाग, पुरस्कार आर 21 CA252172 (सीएमएम) के तहत एनआईएच का राष्ट्रीय कैंसर संस्थान शामिल है। कोलोराडो विश्वविद्यालय में महिला स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए लुडमैन फैमिली सेंटर (डीडीएच और सीएमएम), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान आर 01 HL080396 (सीएमएम), आर 01 HL153096 (सीएमएम), एफ 31 HL151122 (डीडीएच), और टी 32 HL072738 (डीडीएच और एटी) के तहत पुरस्कार आर01 (सीएमएम), आर 01 (सीएमएम), एफ 31 (डीडीएच), और टी 32 (डीडीएच और एटी)।
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
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