Summary
Her gir vi en komplett protokoll for å standardisere og implementere metoden for å oppdage SARS-CoV-2-viruset i humane prøver ved omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk amplifikasjon (RT-LAMP). Denne metoden, utført innen 60 minutter, kan tilpasses ethvert laboratorium eller behandlingssted til en lav pris og ved hjelp av billig utstyr.
Abstract
Det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2)-viruset har dramatisk påvirket menneskers helse. Det fortsetter å være en trussel mot det moderne samfunnet fordi mange mennesker dør som følge av infeksjon. Sykdommen diagnostiseres ved hjelp av serologiske og molekylære tester, for eksempel gullstandarden sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Den siste har flere ulemper fordi den krever spesialisert infrastruktur, kostbart utstyr og opplært personell. Her presenterer vi en protokoll som skisserer trinnene som kreves for å oppdage SARS-CoV-2-viruset ved bruk av omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk amplifikasjon (RT-LAMP) i humane prøver. Protokollen inkluderer instruksjoner for design av primere i silico, klargjøring av reagenser, amplifikasjon og visualisering. Når den er standardisert, kan denne metoden enkelt implementeres og tilpasses ethvert laboratorium eller behandlingssted innen 60 minutter til en lav pris og ved hjelp av billig utstyr. Den kan tilpasses til å oppdage forskjellige patogener. Dermed kan den potensielt brukes i felten og i helsesentre for å utføre rettidig epidemiologisk overvåking.
Introduction
Det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) forårsaker koronavirussykdom 2019 (COVID-19). Verdens helseorganisasjon erklærte en folkehelsekrise av internasjonal bekymring 30 januar 2020 og en pandemi 11 mars 2020. Pandemien resulterte i over 760 millioner tilfeller og 6,87 millioner dødsfall per datoen denne artikkelen ble skrevet1.
Virkningen av dette viruset har fremhevet behovet for bedre, mer nøyaktige, raskere og mer allment tilgjengelige overvåkingsverktøy for å forbedre påvisning og kontroll av smittsomme sykdommer 2,3. Under pandemien var SARS-CoV-2 diagnostiske tester basert på påvisning av nukleinsyre, antistoffer og proteiner, men RT-PCR-deteksjon av nukleinsyre er gullstandarden4. RT-PCR har imidlertid noen begrensninger; Det krever spesialisert utstyr, infrastruktur og personell som er opplært i molekylærbiologi, og begrenser bruken til spesialiserte laboratorier. Videre er det tidkrevende (4-6 timer), ikke inkludert tiden for å transportere prøvene til laboratoriet, noe som kan ta dager5. Disse begrensningene hindrer effektiv prøvebehandling og innhenting av informasjonen som kreves for beredskapsplanlegging og epidemiologisk behandling.
Omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk amplifikasjon (RT-LAMP) har flere fordeler fremfor RT-PCR, noe som gjør det til en tiltalende strategi for å designe fremtidige pasientnære diagnostiske tester (POCT), spesielt i ressursbegrensede omgivelser6. For det første er den veldig spesifikk fordi den bruker mellom fire og seks primere som gjenkjenner seks til åtte områder i målsekvensen, det være seg DNA eller RNA 7,8. For det andre, fordi den opererer ved en konstant temperatur, krever den ikke sofistikert utstyr som sanntids termiske syklister for å generere forsterkningen, og det krever heller ikke høyt utdannet personell for å betjene den. For det tredje er reaksjonstiden svært kort (~60 min), og reagenser som ikke er veldig spesialiserte brukes, noe som gjør det til et kostnadseffektivt verktøy6. Gitt det foregående og helsekrisen forårsaket av COVID-19-pandemien, kan denne teknikken sees på som en alternativ diagnostisk metode som er rask, billig og enkel å implementere i ethvert forskningslaboratorium9.
Protokollen for standardisering og implementering av en RT-LAMP for å oppdage SARS-CoV-2 ved kolorimetriske metoder ved bruk av en termosyklist og et vannbad er beskrevet i denne artikkelen (figur 1). Kritiske punkter, deres begrensninger og alternativer for å fremme dem diskuteres.
Figur 1: Skjema for protokollen for forsterkning av SARS-CoV-2 ved hjelp av RT-LAMP-teknikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøvene som ble brukt ble levert av det kliniske laboratoriet ved Fundación Valle del Lili universitetssykehus og tilsvarte det rensede RNA fra pasienter som testet positivt for COVID-19 ved bruk av RT-qPCR-teknikken. Alle pasienter ga informert samtykke til forskning, og denne studien ble godkjent av den bioetiske komiteen for menneskelige studier fra Fundación Valle del Lili universitetssykehus.
1. RT-LAMP primer design og klargjøring
MERK: LAMP-primere kan brukes med en rekke plattformer, inkludert New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer og LAMP assay versatile analysis (LAVA). For denne protokollen ble imidlertid NEB LAMP-verktøyet brukt. Primerdesign kan gjøres ved å bruke SARS-CoV-2-genomer hentet fra NextStrain database10. Tabell 1 viser primersettet som brukes i denne protokollen.
- Primerdesign for LAMP
- Få virale genomsekvenser.
- Utfør sekvensjusteringer for å oppnå konsensussekvensen.
- Naviger til NEB LAMP primerdesignverktøyplattform11 og følg instruksjonene i hurtigveiledningen. Dette verktøyet gir de samme resultatene som primer explorer V5, men det er mye mer brukervennlig i utgangen. Bruk brukermanualer for primerutforsker som en veiledning for primerdesign.
- Termodynamisk evaluering av settet med primere
- Bruk verktøyet Primer-Dimer12 til å utføre en termodynamisk analyse på de oppnådde primerne.
- Sett primersekvensene i verktøyet. Velg deretter alternativet Multiplex-analyse og Dimer-strukturrapport.
- Velg primersettene som har ΔG ikke mindre enn -5.
- Spesifisitetsevaluering av de designede primerne
- Bruk databasen Nukleotidsamling (nt/nt) i BLAST13 for å analysere hver primer.
- For å utføre den første BLAST-analysen, velg Refseq_rna databasen og filtrer søket med gruppen av slekter som tilhører underfamilien Orthocoronavirinae. De er Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) og Deltacoronavirus (taxid:1159901). I tillegg evaluerer du sekvensen mot andre virus som sirkulerer samtidig som H1N1-undertype (taxid:114727), influensa A-virus (taxid:11320) og Influenza B-virus (taxid:11520).
- For å utføre den andre BLAST-analysen, velg Betacoronavirus GenBank og filtrer søket med Coronaviridae (taxid:11118) og SARS (taxid:694009). Disse gruppene inneholder sekvenser av alle identifiserte SARS Coronavirus-genomer, inkludert genomer funnet i flaggermus, Betacoronavirus (taxid:694002).
- For denne protokollen, sørg for at primerne ikke stemmer overens med andre genomer enn målgenomet, SARS-CoV-2.
- Forberedelse av primer
- Snurr hetteglassene som inneholder de iyofiliserte primerne med en mikrosentrifuge (10 000 x g, 1 min ved romtemperatur [RT]) for å unngå tap under røråpning.
- Rehydrer det iyofiliserte pulveret i 0,1 % dietylpyrokarbonat (DEPC) vann eller nukleasefritt vann til en endelig konsentrasjon på 100 μM (tabell 2) og oppløs grundig ved pipettering opp og ned. Snurr deretter med maksimal hastighet (10 000 x g, 1 min ved RT) i en mikrosentrifuge for å samle alle primerløsningene i bunnen av røret.
- Forbered 10x primerblandingen under et biosikkerhetsskap med den fremre indre primeren (FIP), bakover indre primer (BIP), forover ytre primer (F3), bakover ytre primer (B3), løkke bakover (LB) og løkke fremover (LF) primere, som rapportert i tabell 2. For å forhindre tap, pipetter eller virvler primerløsningen forsiktig før du utfører en rask sentrifugering (10 000 x g, 1 min ved RT) med en mikrosentrifuge.
- Oppbevar 10x primerblandingen ved -20 °C for langtidslagring; Forbered deg imidlertid nok til maksimalt fem eksperimenter, uavhengig av flere prøver for å unngå for mange fryse-tine-sykluser.
MERK Hvis det er behov for et mindre volum av primerblandingen, justerer du verdiene ved å beregne de nye volumene (tabell 2). Videre inkluderer ikke RdRp- og RdRp/Hel-settene LF-primeren fordi sløyfeprimere ikke er nødvendig for RT-LAMP-reaksjoner. Som et resultat, bytt ut volumet av LF-primer med nukleasefritt vann eller 0,1 % DEPC-vann.
2. RT-LAMP-reaksjon
- Slå på det laminære strømningsskapet i henhold til produsentens instruksjoner og vent i minst 3 minutter til luftstrømmen stabiliserer seg.
- Når luftstrømmen er stabil, rengjør og desinfiser de indre overflatene av skapet ved hjelp av en aseptisk teknikk. For å oppnå dette, bruk følgende desinfeksjonsmidler i denne rekkefølgen: 1000 ppm kvartærammonium (benzalkoniumklorid), 2 % hypokloritt, 3 % hydrogenperoksid og 70 % etanol.
MERK: I dette tilfellet innebærer den aseptiske teknikken å påføre desinfeksjonsmidlet og fjerne det med servietter fra innsiden av kabinen til utsiden uten å gå over tidligere rengjorte overflater. - Bruk desinfeksjonsmidlene fra trinn 2.2 til å rengjøre materialene som kommer inn i kabinen i samme rekkefølge.
NOTAT: Mikropipetter, filterspissbokser, kolber med 1.5 ml og 0.6 ml rør, 0.2 ml PCR-rør, stativer og et 400 ml beger må bringes inn i skapet. - Ta med noen servietter og nitrilhansker inn i kabinen. Deretter slår du av skapet og utsetter det for ultrafiolett (UV) lys i 15 minutter.
FORSIKTIG: For å unngå vevs- og DNA-skade fra langvarig strålingseksponering, unngå UV-lys til tiden som er angitt i trinn 2.4 utløper.
MERK Utfør monteringen vist i figur 2 før du starter protokollen, og start vannbadet etter å ha fullført trinn 2.4. Det er avgjørende å fylle metallbeholderen nesten til randen med drikkevann og sette temperaturen på jernlaboratoriets varmeplate til 90 °C, da dette vil resultere i en temperatur på ~66,3 °C i systemet, som overvåkes med kvikksølvtermometeret. - Etter at bestrålingsperioden er over, start skapet på nytt og følg anbefalingene i trinn 1.1.
- Plasser reagensene (tabell 3, tabell 4 og tabell 5) i en isfylt kjøler eller et lite polystyrenkjøleskap. Sett beholderen i skapet etter rengjøring med 70% etanol.
- I et 0,6 ml mikrosentrifugerør forbereder du LAMP-blandingen av genet som skal amplifiseres (RdRp, N-A og RdRp/Hel), og tilsetter bare følgende komponenter: 10x buffer, MgSO4, dNTP-er, 1x primerblanding og nukleasefritt vann eller 0,1 % DEPC-vann; Bland godt ved pipettering for å homogenisere.
FORSIKTIG: På grunn av feil håndtering og oppførsel inne i skapet, er det stor risiko for reagensforurensning. Følgende regler må følges for å redusere dette problemet: (i) bruk sterile og filterspisser; (ii) bruk en spiss for hvert reagens; (iii) bevege seg sakte og forsiktig for å unngå å forstyrre den laminære strømmen; (iv) holde orden og bruke færrest materialer; og (v) bruk forskjellige hansker for å tilberede blandingen og tilsette det genetiske materialet.
NOTAT: Hold alle reagengene, spesielt enzymer, på is fordi temperaturendringer kan denaturere dem og endre polymeraseaktiviteten. - Plasser 0.6 ml røret(e) med lokket lukket i en varmeblokk og inkuber ved 95 °C i 5 minutter.
NOTAT: Slå på varmeblokken for 1.5-2.0 ml rør plassert utenfor skapet i minst 30 minutter før du begynner LAMP blandingsforberedelse og overvåk temperaturen (95 °C) med et kvikksølv- eller alkoholtermometer. - Når inkubasjonen er fullført, plasser rørene i en isfylt polystyrenkjøler i 5 minutter.
- Sett rørene tilbake i det laminære strømningsskapet og fullfør LAMP-blandingsforberedelsen ved å tilsette enzymene DNA-polymerase (Bst 3.0), revers transkriptase og high-fidelity DNA-polymerase (tabell 3, tabell 4 og tabell 5). Ved bruk av kolorimetrisk deteksjon, tilsett fargestoffet hydroksimaftholblått (HNB).
- Etter å ha tilsatt disse reagensene, bland LAMP-reagensene veldig godt ved å pipettere dem for å løse opp enzymene og fargestoffet.
- Fyll hvert PCR-rør med 22.0 μL av blandingen, vær forsiktig så du ikke lager bobler. Tilsett deretter 3.0 μL 0.1 % DEPC-vann eller nukleasefritt vann til den negative kontrollen eller røret uten malkontroll (NTC) og sett av de gjenværende rørene til tilsetningen (genetisk materiale).
NOTAT: Oppbevar PCR-rørene i en isfylt kjøler til sample er tilsatt for å unngå å aktivere Bst 3.0-enzymet og starte reaksjonen for tidlig. - Fjern alt materiale fra skapet og bruk 70 % etanol til å rengjøre overflatene. Slå den deretter av i henhold til produsentens instruksjoner.
- I et eget område, tilsett 3 μL av prøven til hvert PCR-rør og homogeniser den grundig. Bruk en 20 μL mikropipette og filterspisser for å oppnå dette.
FORSIKTIG: Mikropipetten som brukes til å tilsette det genetiske materialet må utelukkende brukes til dette formålet og kan ikke brukes til å tilberede blandingen. På denne måten unngås forurensning av reagensene. I tillegg må du holde RNA-prøver på isen til enhver tid for å redusere muligheten for RNA-nedbrytning. Bruk følgende personlig verneutstyr (PPE) for prøvetillegget: engangskjole, hette, N95-maske, leggings, laboratoriebriller og nitrilhansker. - Før du utfører den kolorimetriske reaksjonen, må du ta bilder av PCR-rørene med et kamera av høy kvalitet. Startfargen med HNB er fiolett.
- Utfør reaksjonen i følgende system eller utstyr: (i) termisk syklist og (ii) vannbad.
- Termisk syklist: Sett rørene inn i reaksjonsblokken og sett opp termoprofilen (se tabell 6) på utstyret.
- Vannbad: Sett rørene i sirkulære beholdere og juster dem veldig godt for å forhindre at de kommer ut. Deretter plasserer du beholderne i vannbadet (Figur 2A, B) ved temperaturen som er oppført i tabell 6.
- Når det gjelder vannbadet, når rørene er inne i systemet, start timeren i 60 minutter (tabell 6).
- Fjern rørene fra den termiske sykkelen eller vannbadet etter reaksjonstiden og oppbevar dem ved 4 °C for elektroforetisk kjøring eller ved -20 °C til bruk.
- Hvis en kolorimetrisk reaksjon ble utført, ta bilder av PCR-rørene ved hjelp av et kamera av høy kvalitet. Den endelige fargen med HNB er himmelblå.
3. Analyse av amplifikasjonsprodukter i agarosegel
MERK: Disse trinnene foreslås som tilleggskontroller for kolorimetrisk reaksjon eller kontroll for ytelse under standardiseringstrinnet. Dette er fordi teknikken kan utgjøre en enorm forurensningsrisiko for laboratoriet som utfører disse testene.
- Plasser sengen inne i elektroforesekammeret slik at kantgummiene berører veggene, og skaper et forseglet rom for tilsetning av agarose (innvendig kammer) (Figur 3A, B).
- Etter å ha fullført trinn 3.1, vei den nødvendige mengden agarose i et 500 ml beger for å få en 2 % gel. Tilsett deretter det nødvendige volumet av 0,5x Tris-acetat EDTA (TAE) buffer og mikrobølgeovn i 1-2 minutter.
NOTAT: Agarosen er helt smeltet når den er gjennomsiktig og klumpfri når den tas ut av ovnen. Hvis dette ikke bekreftes, kan dårlig gelerte områder forbli, noe som fører til at den elektroforetiske kjøringen og visualiseringen av amplifikasjonsproduktene endres. - Ta begeret ut av ovnen og hell agarosen i det indre kammeret som ble opprettet i trinn 3.1 (Figur 3C). Kontroller deretter at det ikke er bobler, og hvis det er det, fjern dem med en mikropipettespiss.
- Ordne kammen for å danne brønnene og la agarosen være gel i ca. 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Etter denne tiden, tilsett 5 ml 0,5x TAE-buffer for å lette fjerningen av kammene og sengen som inneholder gelen. Plasser deretter gelen på en slik måte at brønnene er i anoden (figur 3D).
- Fyll elektroforesekammeret med 0.5x TAE-buffer til kapasiteten spesifisert av produsenten, og sørg for at elektrodene er i kontakt med bufferen.
- Tilsett 3 μL molekylvektmarkør til den første brønnen i gelen og tilsett 9 μL NTC og hver prøve til de følgende brønnene. Lag disse ved å kombinere 7 μL av amplifikasjonsproduktet med 3 μL belastningsbuffer; legg deretter 9 μL av denne blandingen i gelens brønner.
- Dekk elektroforesekammeret med lokket og koble kablene til strømforsyningsportene i fargemønsteret. Still inn strømkilden til følgende parametere: 100 V og konstant strømstyrke i 120 min.
- Etter at den elektroforetiske kjøringen er fullført, plasser gelen i beholderen med fargeløsningen (etidiumbromid) og inkuber i 30 minutter.
- Etter inkubasjon, fjern gelen fra fargeløsningen og legg den i en pose med glidelås. Dette forhindrer forurensning av utstyret som skal brukes til å visualisere amplikene.
- Visualiser gelen på en transilluminator eller kamera som Amersham Imager 600.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implementeringen av protokollen starter med å designe settet med primere for hvert målgen etter protokollen beskrevet ovenfor. I juni 2020 ble 5,000 SARS-CoV-2-genomer hentet fra NextStrain databasen, med en 10 % representativitet av colombianske genomer. Disse sekvensene ble justert for å oppnå konsensussekvensen som ble brukt i primerdesignprosessen. Tabell 1 viser primersettet som er valgt for primerne RdRp/Hel og RdRp. Primersettet for gen N-amplifikasjon ble hentet fra en tidligere publisert rapport14.
Det første trinnet i standardiseringen av protokollen var å unngå NTC-forsterkning. En av de viktigste parametrene som må verifiseres i denne forbindelse er å bestemme den optimale smeltetemperaturen (Tm) og Bst 3.0-konsentrasjonen for settet med primere. En temperaturgradient ble brukt for å bestemme den beste Tm for amplifikasjonen (figur 4A). For settet med primere som ble brukt i denne protokollen, var den optimale Tm 66,3 °C (figur 4A). Videre ble forskjellige konsentrasjoner av Bst 3.0-enzymet evaluert, med 3.2 lU/μL som den optimale konsentrasjonen for den reaksjonen (figur 4B). Konsentrasjonene gitt av Lu et al.15 ble brukt for de resterende reagensene (tabell 3, tabell 4 og tabell 5).
Når den optimale konsentrasjonen av Tm og Bst 3.0 var bestemt, ble amplifikasjonsprosessen utført. Pasientprøvene ble levert av Universitetssykehuset Fundación Valle del Lili. De positive og negative prøvene ble tidligere amplifisert ved hjelp av en konvensjonell RT-PCR-protokoll, og det virale RNA ble deretter brukt til RT-LAMP-amplifikasjon ved bruk av protokollen beskrevet her og betingelsene som er oppført. Amplifiseringen av N-, RdRp/Hel- og RdRp-gener i pasientprøvene, men ikke i NTC er vist i figur 5A,B. Gitt at RT-LAMP er en tiltalende strategi for å designe POCT i fremtiden, ble forsterkningene i denne protokollen implementert i en konvensjonell termisk syklist og et vannbad (figur 6).
Det andre trinnet i standardiseringen av protokollen var å definere den kolorimetriske strategien, så fenolrødt og nøytralt rødt var de første fargestoffene som ble evaluert; for evalueringen ble forskjellige fargestoffkonsentrasjoner undersøkt (figur 7), men ingen fargeendring ble observert etter amplifikasjon med noen av de testede konsentrasjonene. Dette resultatet kan forklares med det faktum at begge fargestoffene er pH-indikatorer, noe som betyr at de er følsomme for pH i prøven, spesielt hvis det virale RNA ble eluert i buffer TE, noe som var tilfellet for pasientprøvene evaluert med denne protokollen. Hydroxy Naphthol Blue (HNB) ble undersøkt fordi fargen endres med endringer i Mg2+-konsentrasjonen, som vil bli redusert under amplifikasjonsreaksjonen som en kofaktor av polymeraseenzymet. I dette tilfellet ble forskjellige konsentrasjoner av HNB testet for å bestemme hvilken som tillot den beste fargeendringen etter amplifikasjon, som oppstår i reaksjonen med 125 μM HNB (figur 8). En fullstendig beskrivelse av reagenser som brukes i fremstillingen av amplifikasjonsblandingen for N- og RdRp/Hel-gener ved kolorimetrisk LAMP er inkludert i tabell 5.
Etter å ha bestemt de beste forholdene for kolorimetrisk deteksjon, ble pasientprøver med varierende antall virale genomer amplifisert. Figur 9 viser amplifiseringen av prøvene, der det oppstår en fargeendring i prøvene i henhold til konsentrasjonen av det virale genomet. Forsterkningsresultatene ble også visualisert ved hjelp av agaroseelektroforese, som bekreftet amplifikasjonen av pasientprøver, men ikke NTC.
Figur 2: Diagram over vannbadet som brukes til å amplifisere SARS-CoV-2-gener ved hjelp av LAMP-teknikken. (A) Sett forfra og (B) sett ovenfra. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Elektroforesekammermontering. (A) Diagram over elektroforesekammeret som brukes til å skille PCR-produktene. (B) Dannelse av det indre kammeret for fremstilling av agarosegelen. (C) Tilsetning av den smeltede agarosen i det indre kammeret. (D) Demontering av det indre kammeret for å få plass til gelen i kjørestilling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Standardisering av amplifikasjonsbetingelsene til primerne og enzymet Bst 3.0. (A) Hvert kjørefelt viser en annen gradienttemperatur, fra 63 °C til 67 °C. Fra venstre til høyre, molekylvektmarkør (MWM), ingen malkontroll (-), bane 1: 67 °C; bane 2: 66,8 °C; bane 3: 66,3 °C; bane 4: 65,5 °C; bane 5: 64,6 °C; bane 6: 63,9 °C; bane 7: 63,4 °C; bane 8: 63 °C. (B) B1: 8,0 U/μL av Bst 3.0; B2: 6,4 U/μL av Bst 3,0; B3: 4,8 U/μL av Bst 3,0; B4: 3,2 U/μL av Bst 3,0; 1: Ingen malkontroll; og 2: pasientprøve EEDD8 (Ct = 23,39). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Agarosegelelektroforese av amplifikasjonsproduktene til N- og RdRp/Hel-genene som er tilstede i SARS-CoV-2-viruset ved bruk av LAMP-teknikken. (A) Repliker 1 og (B) Repliker 2, hvor MWM: molekylvektmarkør; 1: Ingen malkontroll; 2: pasientprøve E1123 (Ct = 19,95); 3: pasientprøve E1324 (Ct = 26,01); 4: pasientprøve EEDD10 (Ct = 30,09); RH: RdRp/Hel-genet og N:N-genet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Agarosegelelektroforese av amplifikasjonsproduktene til RdRp-genet som er tilstede i SARS-CoV-2-viruset ved bruk av LAMP-teknikken. Reaksjonen ble utført i (A) en termisk syklist og (B) et vannbadsystem. MPM: markør for molekylvekt; 1: Ingen malkontroll; 2: pasientprøve E1123 (Ct = 19,95); 3: pasientprøve E1757 (Ct = 23,67); 4: pasientprøve E1604 (Ct = 23,98); 5: pasientprøve E1245 (Ct = 25,99); 6: pasientprøve E1324 (Ct = 26,01); 7: pasientprøve EEDD7 (Ct = 26,56); 8: pasientprøve 24 (Ct = 37,99) og R: RdRp-gen. *Refererer til forsterkningene som ble utsatt for 60 minutters reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forsterkning av RdRp-genet tilstede i SARS-CoV-2-viruset ved bruk av LAMP-teknikken med kolorimetrisk deteksjon. Rør (A) før og (B) etter reaksjonen, hvor 1: Ingen malkontroll; 2: pasientprøve E1123 (Ct=19,95); 3: pasientprøve E1757 (Ct=23.67); 4: pasientprøve E1324 (Ct=26,01); PR: Fenolrød; og NR: Nøytral rød. For hvert fargestoff ble fire konsentrasjoner evaluert i den endelige reaksjonen (50 μM, 75 μM, 100 μM og 120 μM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Forsterkning av RdRp-genet tilstede i SARS-CoV-2-viruset ved hjelp av den kolorimetriske LAMP-teknikken, ved bruk av den blå hydroksynaftolindikatoren. Rør (A) før og (B) etter reaksjonen, hvor 1: Ingen malkontroll; 2: pasientprøve E1594 (Ct=20.75); 3: pasientprøve E990 (Ct=22,67); 4: pasientprøve E1245 (Ct=25,99). For dette fargestoffet ble fire konsentrasjoner evaluert i den endelige reaksjonen (50 μM, 75 μM, 100 μM og 125 μM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Forsterkning av prøvene. Rør (A) før og (B) etter reaksjon med LAMP ved bruk av den blå hydroksynaftholindikatoren. (C) Agarosegelelektroforese av amplifikasjonsproduktene til N-genet som er tilstede i SARS-CoV-2-viruset ved bruk av den kolorimetriske LAMP-teknikken. MPM: markør for molekylvekt; NTC: Ingen malkontroll; S1: pasientprøve E1594 (Ct = 20,75); S2: pasientprøve E990 (Ct = 22,67); S3: pasientprøve E1245 (Ct = 25,99). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mål-gen | Grunning | Primersekvens (5' → 3') | |||
| N (Zhang et al., 2020) |
N-F3 | TGGCTACTACCGAAGAGCT | |||
| N-B3 | TGCAGCATTGTTAGCAGGAT | ||||
| N-FIP | TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGGGG | ||||
| N-BIP | AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT | ||||
| N-LF | GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT | ||||
| N-LB | ACTGAGGGAGCCTTGAATACA | ||||
| RdRp | R-F3 | CTATGGTGGTTGGCACAA | |||
| R-B3 | TTGAGCACACTCATTAGCT | ||||
| R-FIP | GCATGGCTCTATCACATTTAGGATA-GTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTC | ||||
| R-BIP | ACATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-TCTATAGAAACGGTGTGACAAG | ||||
| R-LB | TGTTCTTGCTCGCAAACATACAACG | ||||
| RdRp/Hel | RH-F3 | GGTATTGGGAACCTGAGTT | |||
| RH-B3 | GACAAGACTAATTTATGTGATGTGTTG | ||||
| RH-FIP | GCAAAGAACACAAGCCCCAACTTATGAGGCTATGTACACACC | ||||
| RH-BIP | TTCACAGACTTCATTAAGATGTGGTACATGGTCGTAACAGCAT | ||||
| RH-LB | GCTTGCATACGTAGACCATTCTT | ||||
Tabell 1: Primersekvenser for SARS-CoV-2-deteksjon med RT-LAMP.
| Komponent | Lager (μM) | Primer Mix 10x (μM) | Volum (μL) |
| Fremre ytre primer (F3) | 100 | 2 | 12.5 |
| Bakovervendt ytre primer (B3) | 100 | 2 | 12.5 |
| Indre primer fremover (FIP) | 100 | 8 | 50 |
| Bakover indre primer (BIP) | 100 | 8 | 50 |
| Sløyfe fremover (LF) | 100 | 4 | 25 |
| Sløyfe bakover (LB) | 100 | 4 | 25 |
| Nukleasefritt vann* | --- | --- | 450 |
| Totalt volum | 625 | ||
Tabell 2: Tilberedning av 10x RT-LAMP primerblanding. RdRp-genprimerblandingen inneholder ikke LF-primeren; erstatt derfor dette volumet med nukleasefritt vann. *I stedet for nukleasefritt vann kan 10 mM Tris pH 8,0 fremstilt i DEPC 0,1 % vann brukes.
| Vare | Reagenser | Endelig konsentrasjon for 25 μL | 1 prøve (μL) |
| 1 | 10x buffer | 1x | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 4 mM + 2 mM i buffer = 6 mM | 1.0 |
| 3 | 10 mM dNTP-er | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Mix primere | 1x [0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3,0 DNA-pol (8000 IE/ml) | 3,2 IE | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 IE/ml) | 1,5 IE | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA-pol (2000 IE/ml) | 0,15 IE | 0.1 |
| 8 | Nukleasefritt vann | N/A | 11.9 |
| 9 | RNA-prøve | N/A | 3.0 |
| 10 | Totalt reaksjonsvolum | 25 | |
Tabell 3: Fremstilling av RdRp-genamplifikasjonsblandingen med LAMP.
| Vare | Reagenser | Endelig konsentrasjon for 25 μL | 1 prøve (μL) |
| 1 | 10x buffer | 1x | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 6 mM + 2 mM i buffer = 8 mM | 1.5 |
| 3 | 10 mM dNTP-er | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Mix primere | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3,0 DNA-pol (8000 IE/ml) | 3,2 IE | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 IE/ml) | 1,5 IE | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA-pol (2000 IE/ml) | 0,15 IE | 0.1 |
| 8 | Nukleasefritt vann | N/A | 11.4 |
| 9 | RNA-prøve | N/A | 3.0 |
| 10 | Totalt reaksjonsvolum | 25 | |
Tabell 4: Fremstilling av amplifikasjonsblandingen av N-A og RdRp/Hel-genene med LAMP.
| Vare | Reagenser | Endelig konsentrasjon for 25 μL | 1 prøve (μL) |
| 1 | 10x buffer | 1x | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 6,5 mM + 2 mM i buffer = 8,5 mM | 1.6 |
| 3 | 10 mM dNTP-er | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Mix primere | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | 1 mM Hydroxy naftol blå | 125 μM | 3.1 |
| 6 | Bst 3,0 DNA-pol (8000 IE/ml) | 3,2 IE | 0.4 |
| 7 | RTx (15000 IE/ml) | 1,5 IE | 0.1 |
| 8 | Q5 DNA-pol (2000 IE/ml) | 0,15 IE | 0.1 |
| 9 | Nukleasefritt vann | N/A | 8.2 |
| 10 | RNA-prøve | N/A | 3.0 |
| 11 | Totalt reaksjonsvolum | 25 | |
Tabell 5: Fremstilling av amplifikasjonsblandingen av N-A- og RdRp/Hel-genene ved kolorimetrisk LAMP.
| Temperatur | Tid |
| 66,3 °C | 60 min |
| 80 °C | 5 min |
| 4 °C | ∞ |
Tabell 6: Termiske forhold brukt for amplifisering av RdRp-, N-A- og RdRp/Hel-genene av LAMP.
| Fargestoff | pH-avhengig | Farge før reaksjon | Farge etter reaksjon | Kommentarer | ||
| Hydroxy naftol blå | Nei | Fiolett | Himmelblå | Med dette fargestoffet er magnesiumkonsentrasjonen kritisk og må være mellom 8 mM og 8,5 mM i den endelige reaksjonen. På denne måten er fargeovergangen fra fiolett til himmelblå garantert. | ||
| Kresol rød | Ja | Fuscia | Gul | Tilstedeværelsen av buffere i RNA-eluatene eller i reagensene kan forhindre reduksjon av pH og påvirke fargeendringen når reaksjonen er ferdig. Når det gjelder RNA og primere, anbefales det derfor ikke å bruke TE-buffer til henholdsvis eluering og resuspendering/fortynning. | ||
| Nøytral rød | Ja | Svakt gul eller svakt oransje | Fuscia | |||
| Fenol rød | Ja | Fuscia | Gul | |||
Tabell 7: Sammenligning av fargestoffene som brukes i visuell deteksjon av kolorimetrisk LAMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om RT-LAMP blir sett på som en komplementær metodikk for å utføre molekylær diagnostikk, har den også noen begrensninger og kritiske trinn som må vurderes når protokollen standardiseres og implementeres.
LAMP-standardiseringen for påvisning av SARS-CoV-2 evaluerte følgende parametere og komponenter i masterblandingen: (a) konsentrasjon og temperatur for justering av primerne; (b) konsentrasjon av enzymene; (c) magnesiumkonsentrasjon; (d) reaksjonstid; (e) inkludering av tilsetningsstoffer som BSA, DMSO, Guanidiniumklorid; (f) utforming av primerne; (g) tilsetning av fargestoff; (h) bruk av reaksjonsbuffere og rekombinante enzymer produsert internt.
Denne standardiseringsprosessen begynte med seks sett med primere, to rapportert av Zhang et al.14 og fire designet av BioDx-selskapet. Sistnevnte ble designet fra bunnen av med tilgjengelige nettbaserte verktøy og ble valgt for sin høye spesifisitet mot SARS-CoV-2, som bestemt av BLAST. I tillegg viste deres termodynamiske evaluering en lavere tendens til å danne primerdimerer eller hårnålsstrukturer som favoriserte selvforsterkning.
På grunn av innvirkningen primere har på standardiseringen av teknikken og resultatene av tidligere eksperimenter der amplifikasjon ble funnet i NTC-er, ble det laget et nytt primerdesign for N-, S-, RdRp- og RdRp/Hel-genene. Disse ble utsatt for flere bioinformatiske analyser for å garantere deres spesifisitet og reduksjon av tendensen til å danne selvforsterkende strukturer. De utvalgte primerne oppfylte de etablerte bioinformatikkparametrene (ΔG > -5.0 og spesifisitet demonstrert av BLAST).
In silico-analyser har en svært viktig rolle i å forutsi oppførselen som kan observeres i in vitro-reaksjoner siden de kan brukes som et innledende filter for valg av primere. Disse spådommene er imidlertid ikke de samme i alle tilfeller; derfor kan de ikke brukes som en definitiv utvalgsparameter, men snarere som en innledende tilnærming. Den faktiske oppførselen til primerne i teknikken bestemmes direkte under reaksjonen og den visuelle evalueringen ved kolorimetri eller på en agarosegel. Til slutt blir tvilsomme eller uklare resultater vanligvis gjentatt av en annen analytiker eller forkastet; siden et inkonklusivt resultat ikke kan rapporteres i sammenheng med diagnosen.
Et av de viktigste kritiske trinnene er den høye sannsynligheten for kontaminering når protokollen utvikles, noe som gjenspeiles i forsterkningen av NTC. Dette kan unngås ved å følge god laboratoriepraksis som riktig desinfiserings- og rengjøringsprosedyrer før håndtering av reagenser og prøver, alltid bruke nødvendig PPE, håndtere redskaper med forsiktighet inne i det laminære strømningsskapet, og utvikle hvert trinn i prosessen i separate rom for eksklusiv bruk, for eksempel et rom for å blande reagenser, et annet for å legge til prøven som skal evalueres og et annet for å utføre amplifikasjonsprosessen.
NTC-forsterkningen kan være forårsaket av forurensning, men også av primerdimerisering. Av denne grunn er et annet kritisk trinn primerdesignet og å identifisere de optimale forholdene for å forhindre primerdimerisering. Det er avgjørende i primerdesignprosessen å finne primersettet med termodynamiske parametere som reduserer sannsynligheten for at sekundære strukturer dannes, som måles med fri energi, så en termodynamisk evaluering av det valgte primersettet er nødvendig. I denne protokollen ble PrimerDimer-verktøyet12 brukt for den termodynamiske evalueringen; med Multiplex-undersøkelsesalternativet screenes hver primer mot alle andre primere i bassenget for potensielle dimerformasjoner, og Dimer Framework Report-alternativet rapporterer rammeverket til den mest stabile dimeren av hvert primerpar. Denne informasjonen er veldig nyttig når du velger et godt sett med primere.
Videre er det avgjørende å identifisere passende reagenskonsentrasjon som MgSO4, dNTP-er, primere, Bst 3.0-enzym og amplifikasjonsparametere som Tm og inkubasjonstid for å forhindre primerdimerisering under amplifikasjonsprosessen. I tillegg, det er mulig å tilsette forbindelser som reduserer dannelsen av primerdimerer under amplifikasjon, for eksempel bovint serumalbumin, dimetylsulfoksid (DMSO)16 og guanidiniumklorid17.
Et annet kritisk aspekt ved primerdesignprosessen er å bestemme spesifisiteten til hver primer. For denne protokollen ble denne evalueringen gjort med BLAST. Det er imidlertid også viktig å evaluere spesifisiteten til primeramplifikasjonsprosessen ved å bruke et annet virus som er fylogenetisk beslektet, men ikke relatert til SARS-CoV-2.
På den annen side ble ikke sensitiviteten og deteksjonsgrensen (minimum antall påvisbare genomer) bestemt under standardiseringen av teknikken. For det første ble prøvene levert av universitetssykehuset Fundación Valle del Lili ikke kvantifisert for å bestemme antallet virale kopier på grunn av interne restriksjoner avledet fra den sanitære beredskapen som var på plass på den tiden i Colombia (2020). Estimatet av konsentrasjonen av genetisk materiale ble tilnærmet med Cq for RT-qPCR siden jo lavere Cq, jo høyere antall virale kopier, mens jo høyere Cq, jo lavere antall virale kopier. Den laveste Cq som ble testet var 14,81, og den høyeste var 38,93, hvor ingen forsterkningsprodukter vises. I tillegg var RT-qPCR-testen som ble godkjent for bruk i Colombia i 2020 kvalitativ og ikke kvantitativ, det vil si bare bestemt tilstedeværelse eller fravær i henhold til Cq. Et resultat med Cq ≥ 40 var negativt, men et Cq < 40 var positivt. Protokollene som ble brukt i Colombia for påvisning av COVID-19 var Berlin-protokollen1, CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR diagnostisk panel2, og spesielt i universitetssykehuset Fundación Valle del Lili, Allplex 2019-nCoV Assay3 ble brukt. Dessverre har vi ikke flere prøver godkjent av den etiske komiteen levert av universitetssykehuset Fundación Valle del Lili for å fortsette med disse eksperimentene.
I tillegg er tilgjengeligheten av reagenser en betydelig barriere for rettidig diagnostisering av nye tilfeller i en global folkehelsekrise, den som er forårsaket av SARS-CoV-2. Som et resultat ble denne protokollen laget for å unngå bruk av importerte og kostbare kommersielle sett og reagenser, og klargjøringen av amplifikasjonsbufferne er beskrevet i denne protokollen. Videre ble noen fargestoffer som kunne brukes i kolorimetrianalyser evaluert, samt noen hensyn til bruken av dem (tabell 7).
Denne diagnostiske metoden har noen begrensninger fordi den ikke tillater kvantifisering av det virale genomet i prøven. I tillegg er fargedeteksjon et subjektivt mål fordi det avhenger av den visuelle kapasiteten til personen som utfører protokollen. Men fordi den ikke krever spesialisert utstyr eller personell som er opplært i molekylærbiologi, kan denne protokollen tilpasses påvisning av forskjellige patogener og kan enkelt implementeres når den er standardisert. Dermed kan anvendelsen utvides til andre prøver, for eksempelmiljø-18,19,20 og helsesentre, for å utføre rettidig epidemiologisk overvåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Natalia Campillo-Pedroza er administrerende direktør i selskapet BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. Resten av forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Sistema General de Regalías fra Colombia, stipendnummer BPIN 2020000100092, og Universidad Icesi - Convocatoria Interna, stipendnummer CA0413119. MFVT ble også finansiert av assisterende professoratmidler fra Universidad de los Andes. Finansiørene deltok ikke i utforming, gjennomføring av aktiviteter, datainnsamling og dataanalyse og utarbeiding av manus. Vi takker Universitetssykehuset Fundación Valle del Lili for viralt RNA fra Sars-CoV-2-prøver og Dr. Alvaro Barrera-Ocampo for kommentarene til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb DNA Ladder | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Store at -20 °C |
| 50x TAE Electrophoresis Buffer | ThermoScientific | B49 | Store at roome temperature |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | Store at -20 °C |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Handle it with caution under an extraction cabinet |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use | ThermoScientific | SM0322 | Store at -20 °C |
| Hydroxy naphthol blue disodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL | New England BioLabs | M0491S/M0491L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
References
- World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
- Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).
- Rojas-Gallardo, D. M., et al. COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America). medRxiv. , (2020).
- Liu, R., et al. Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020. Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).
- Kevadiya, B. D., et al.
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens. Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).
- Augustine, R., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic. Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).
- Nextstrain. , https://nextstrain.org/ (2023).
- Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).
- PrimerDimer. , http://www.primer-dimer.com/ (2023).
- National Center for Biotechnology Information. Blast: Basic local alignment search tool (no date). , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (2023).
- Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
- Lu, R., et al. Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2. Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).
- Najafov, A., Hoxhaj, G. PCR Guru. , Elsevier, Academic Press. (2017).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Ramírez-Chavarría, R. G., et al. Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study. Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).
- Haque, M. F. U., et al. A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan. Virus Research. 302, 198484 (2021).
- Donia, A., et al. Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform. Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).
