Knockdown de FAM83A pour vérifier son rôle dans la croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus et la sensibilité au cisplatine
Summary
Ici, nous montrons les procédures pour le knockdown FAM83A ; les tests permettant de détecter ses effets sur la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus ; et la sensibilisation de ces cellules au cisplatine. Cette étude fournit un gène cible prometteur pour le cancer du col de l’utérus et une référence pour la recherche de médicaments ultérieurs.
Abstract
L’exploration des gènes cibles tumoraux revêt une importance capitale pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. Dans cette étude, nous décrivons les étapes impliquées dans l’identification d’un gène cible tumoral FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Tout d’abord, l’ensemble de données de l’Atlas du génome du cancer a été utilisé pour valider l’expression et la signification pronostique de FAM83A chez les femmes. Un petit ARN interférent (siRNA) a été utilisé pour inhiber le gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . Ensuite, une coloration à la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) a été effectuée pour déterminer les effets sur les capacités de prolifération des cellules tumorales. Des tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont été effectués pour évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.
Le Western blot a été utilisé pour quantifier les niveaux de protéines liées à l’apoptose. La coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. De plus, l’intervention du cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP) a été utilisée pour évaluer le potentiel thérapeutique du gène cible. Des tests de cytométrie en flux et de formation de colonies ont été effectués pour valider davantage les caractéristiques anticancéreuses du gène. En conséquence, il a été démontré que le knockdown de FAM83A inhibe la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et sensibilise ces cellules au cisplatine. Ces méthodologies complètes valident collectivement FAM83A en tant que gène cible associé à la tumeur, prometteur en tant que cible thérapeutique potentielle dans la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus.
Introduction
Le cancer du col de l’utérus est une préoccupation mondiale car il s’agit de l’un des principaux types de tumeurs malignes gynécologiques dans le monde et de la principale cause de mortalité liée au cancer chez les femmes1. La chirurgie radicale et la chimioradiothérapie sont associées à des taux de guérison élevés au stade primaire. Cependant, les résultats du traitement pour les patientes à un stade avancé du cancer du col de l’utérus qui développent une maladie métastatique sont très défavorables2. Par conséquent, il est crucial de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à la migration et à l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la prévention et le traitement de cette maladie.
L’identification des gènes cibles impliqués dans la progression du cancer et la recherche de moyens d’inhiber leur expression ou leur action présentent des options thérapeutiques prometteuses. Dans cette étude, nous avons identifié FAM83 comme un gène cancérigène et étudié plus en détail ses effets inhibiteurs sur les cellules C33a et HeLa. Les oncogènes de la famille FAM83 (FAM83A-H) sont largement rapportés dans les cancers humains 3,4. Récemment, il a été rapporté que FAM83A était régulé à la hausse dans les cancers du poumon5, du sein6, de l’ovaire7 et du pancréas8, ce qui indique que FAM83A joue un rôle important dans la progression du cancer en favorisant la prolifération, l’invasion, les traits de type cellule souche et la résistance aux médicaments dans les cellules tumorales. Il est important de noter que FAM83A a été identifié comme l’un des nouveaux gènes candidats associés à la progression des lésions cervicales et à la cancérogenèse9. Malgré la confirmation de l’expression élevée de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus humain, l’impact spécifique et les mécanismes sous-jacents de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus restent incertains.
Dans cette étude, nous décrivons les protocoles impliqués dans l’identification de FAM83A en tant que gène cible de la tumeur dans le cancer du col de l’utérus et utilisons un petit ARN interférent (siRNA) pour l’inactivation du gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . La coloration à la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) a été réalisée pour déterminer les effets sur la prolifération des cellules tumorales, tandis que les tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont permis d’évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.
Un transfert Western a été effectué pour déterminer les niveaux de protéines liées à l’apoptose, et la coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. Ainsi, nous avons rapporté que FAM83A joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, les métastases et l’invasion dans le cancer du col de l’utérus. Grâce à un dysfonctionnement mitochondrial et à l’apoptose associés à la voie PI3K/AKT, FAM83A a sensibilisé les cellules cancéreuses du col de l’utérus au cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP). Cette étude fournit une nouvelle cible pour le cancer du col de l’utérus et possiblement d’autres cancers et une référence pour le développement de stratégies visant à surmonter la résistance des cellules cancéreuses à certains médicaments chimiothérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude des gènes cibles de la tumeur est de la plus haute importance pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. La compréhension des gènes spécifiques qui jouent un rôle important dans le développement et la progression du cancer du col de l’utérus fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie. De plus, l’identification de ces gènes cibles peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et de thérapies…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation du Bureau des sciences et de la technologie de Jingzhou (n° 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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