Microscopia de dois fótons sensível à polarização para caracterização estrutural amiloide livre de marcação

Summary

Este trabalho descreve como a microscopia de dois fótons sensível à polarização pode ser aplicada para caracterizar a organização local dentro de superestruturas-esferulitos amiloides livres de marcação. Também descreve como preparar e medir a amostra, montar a configuração necessária e analisar os dados para obter informações sobre a organização local das fibrilas amiloides.

Abstract

Em comparação com sua contraparte de um fóton, a excitação de dois fótons é benéfica para experimentos de bioimagem devido à sua menor fototoxicidade, penetração mais profunda do tecido, operação eficiente em sistemas densamente compactados e fotoseleção angular reduzida de fluoróforos. Assim, a introdução da análise de polarização em microscopia de fluorescência de dois fótons (MAP2) fornece uma determinação mais precisa da organização molecular em uma amostra em comparação com métodos de imagem padrão baseados em processos ópticos lineares. Neste trabalho, enfocamos a 2PFM sensível à polarização (ps-2PFM) e sua aplicação na determinação da ordenação molecular dentro de bioestruturas complexas-esferulitos amiloides. Doenças neurodegenerativas como Alzheimer ou Parkinson são frequentemente diagnosticadas através da detecção de agregados de proteínas amiloides-formadas devido a um processo de enovelamento incorreto de proteínas. A exploração de sua estrutura leva a uma melhor compreensão de seu caminho de criação e, consequentemente, ao desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis. Este trabalho apresenta os ps-2PFM adaptados para a determinação da ordenação de fibrilas locais no interior de esferulitos insulínicos bovinos e agregados proteicos amiloidogênicos esféricos. Além disso, comprovamos que a técnica proposta pode resolver a organização tridimensional das fibrilas no interior da esferulite.

Introduction

Nas últimas décadas, embora tenha havido um desenvolvimento significativo de inúmeras técnicas de microscopia de fluorescência para bioimagem de proteínas e seus^agregados1, poucas têm sido utilizadas para resolver sua ordenação local dentro da amostra ^2,3. A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência⁴ foi usada para estudar a heterogeneidade estrutural intrínseca de superestruturas-esferulitos amiloides. Além disso, a determinação quantitativa da ordenação local dentro de bioestruturas complexas e densamente compactadas, como esferulitos, poderia ser resolvida usando métodos sensíveis à polarização³. No entanto, as técnicas padrão de fluorescência com penetração de tecido superficial são limitadas, uma vez que o uso de comprimentos de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo leva a um alto espalhamento de luz tecidual⁵. Além disso, essas imagens geralmente requerem o projeto e a ligação de sondas fluorescentes específicas a uma biomolécula alvo, aumentando assim o custo e a quantidade de trabalho necessário para realizar imagens.

Recentemente, para abordar essas questões, nossa equipe adaptou microscopia de fluorescência excitada de dois fótons sensível à polarização (ps-2PFM) para imagens livres de marcação de estruturas biológicas ^6,7. A MAPP Ps-2 permite medir a dependência da intensidade de fluorescência de dois fótons na direção de polarização linear do feixe de excitação e analisar a polarização da fluorescência emitida⁸. A implementação desta técnica requer a complementação do caminho de excitação padrão do microscópio multifóton (Figura 1) com uma placa de meia-onda para controlar o plano de polarização da luz. Em seguida, gráficos polares, retratando a dependência da intensidade de fluorescência excitada de dois fótons na polarização do feixe de laser de excitação, são criados a partir de sinais coletados por dois fotodiodos de avalanche, coletando assim os dois componentes mutuamente perpendiculares da polarização de fluorescência.

A última etapa é o processo de análise dos dados, levando em conta o impacto dos elementos ópticos, como espelhos dicroicos ou uma objetiva de alta abertura numérica, na polarização. Devido à natureza do processo de dois fótons, este método fornece tanto uma foto-seleção angular reduzida quanto uma resolução axial aprimorada, já que a excitação de dois fótons de fluoróforos fora do plano focal é probabilisticamente limitada. Também foi comprovado que métodos semelhantes poderiam ser implementados com sucesso para imagens in vivo de sondas de infravermelho próximo (NIR) para imagens de tecidos profundos⁹. A Ps-2PFM foi previamente aplicada em fluoróforos de imagem em membranas celulares¹⁰ e DNA^11,12, bem como marcadores fluorescentes não padronizados de sistemas biológicos, como nanopartículas de ouro¹³. No entanto, em todos esses exemplos, as informações sobre a organização de biomoléculas foram obtidas indiretamente e exigiram uma orientação mútua pré-definida entre um fluoróforo e uma biomolécula.

Em um de nossos trabalhos recentes, mostramos que a ps-2PFM pode ser aplicada com sucesso para determinar a polarização local da autofluorescência de superestruturas amiloides e fluorescência a partir de tioflavina T, um corante amilóide-específico, ligado a fibrilas amiloides em esferulitos⁶. Além disso, em outro, comprovamos que a ps-2PFM poderia ser utilizada para detectar a orientação da fibrila amiloide dentro de esferulitos amiloides em um regime de tamanho sub-mícron, o que foi confirmado pela correlação com imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET)⁷. A obtenção deste resultado foi possível graças a i) autofluorescência intrínseca de esferulitos-amiloides, quando excitadas com um ou dois fótons, exibem autofluorescência intrínseca com máximos de emissão localizados em uma faixa de 450 a 500 nm e seções transversais de absorção de dois fótons comparáveis com corantes fluorescentes padrão¹⁴, ii) modelos matemáticos introduzidos anteriormente para descrever como ps-2PEF de corantes marcando membranas biológicas e estruturas de DNA poderiam ser aplicados a fluorescência exibida por esferulitos e corantes a eles ligados ^8,11,15. Assim, antes de prosseguir com a análise, é altamente recomendável examinar a teoria necessária descrita no texto principal e nas informações de apoio de nosso primeiro artigo sobre este tópico⁶. Apresentamos aqui o protocolo de aplicação da técnica de ps-2PFM para a caracterização estrutural amiloide livre de rótulos de esferulitos de insulina bovina.

Protocol

1. Preparar as lâminas do microscópio com esferulites totalmente crescidos NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtida do sistema de purificação de água. Incubar os esferulitos amiloides com base no protocolo descrito por Krebs e cols.16, …

Representative Results

O protocolo apresentado fornece orientação passo a passo através da preparação de superestruturas amiloides para testes com ps-2PFM, construção do sistema microscópico e medidas da amostra adequada. No entanto, antes do conjunto final de medidas, é vital alinhar adequadamente as DPAs com uma referência isotrópica, o que deve resultar na coleta de um sinal simétrico de forma e intensidade semelhantes em ambos os detectores (Figura 4C). Mesmo diferenças mínimas entre as intensida…

Discussion

A microscopia de dois fótons sensível à polarização é uma ferramenta valiosa para estudar a ordenação local de fibrilas dentro das superestruturas amiloides, exigindo apenas pequenas modificações na configuração padrão de multifótons. Uma vez que opera em fenômenos ópticos não lineares, a foto-seleção angular reduzida e a resolução axial aprimorada podem ser obtidas em comparação com métodos de microscopia de fluorescência excitada de um fóton. Além disso, leva a menor espalhamento de luz, meno…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5