自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験
Summary
このプロトコルでは、自動化されたプラットフォーム Lustro を利用して、酵母の光遺伝学的システムのハイスループット特性評価を実行する手順を概説します。
Abstract
オプトジェネティクスは、遺伝的にコードされた光感受性タンパク質を利用することで、細胞の挙動を正確に制御します。しかし、これらのシステムを最適化して目的の機能を実現するには、多くの場合、設計、構築、テストのサイクルを複数回必要とし、時間と労力がかかります。この課題に対処するために、光刺激とラボラトリーオートメーションを組み合わせたプラットフォームであるLustroを開発し、オプトジェネティックシステムの効率的なハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にしました。
Lustro は、照明装置、振とう装置、プレートリーダーを備えた自動化ワークステーションを利用しています。Lustroは、ロボットアームを採用することで、これらのデバイス間のマイクロウェルプレートの移動を自動化し、光遺伝学的株の刺激とその応答の測定を可能にします。このプロトコルは出芽のイースト Saccharomycesのcerevisiaeの遺伝子発現制御のための光遺伝学システムを特徴付けるのにLustroの使用のステップバイステップガイドを提供する。このプロトコルは、照明装置とオートメーションワークステーションの統合など、Lustroのコンポーネントのセットアップをカバーしています。また、照明装置、プレートリーダー、ロボットのプログラミングに関する詳細な指示も提供し、実験プロセス全体を通してスムーズな操作とデータ取得を保証します。
Introduction
オプトジェネティクスは、光感受性タンパク質を利用して細胞の挙動を高精度に制御する強力な技術です1,2,3。しかし、オプトジェネティックコンストラクトのプロトタイピングと最適な照明条件の特定には時間がかかる場合があり、オプトジェネティックシステムの最適化は困難です4,5。オプトジェネティックシステムの活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するハイスループットメソッドは、コンストラクトのプロトタイピングとその機能の調査のための設計、構築、テストのサイクルを加速させることができます。
Lustro プラットフォームは、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価のために設計されたラボラトリーオートメーション技術として開発されました。マイクロプレートリーダー、照明装置、振とう装置をオートメーションワークステーション6と統合しています。Lustro は、マイクロウェルプレート(図1および補足図1)で細胞の自動培養と光刺激を組み合わせており、さまざまなオプトジェネティックシステムの迅速なスクリーニングと比較を可能にします。Lustroプラットフォームは適応性が高く、他のラボラトリーオートメーションロボット、照明装置、プレートリーダー、細胞タイプ、およびさまざまな波長の光に応答するものを含む光遺伝学的システムで動作するように一般化できます。
このプロトコルは、光遺伝学的システムの特性評価のためのLustrroのセットアップと使用を示しています。酵母における分裂転写因子の光遺伝学的制御は、光入力と蛍光レポーター遺伝子mScarlet-I7の発現との関係を調べることにより、プラットフォームの機能と有用性を説明するための例として使用されています。このプロトコルに従うことで、研究者は光遺伝学的システムの最適化を合理化し、生物学的システムの動的制御のための新しい戦略の発見を加速することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するLustroプロトコルは、培養、照明、測定プロセスを自動化し、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にします6。これは、照明装置、マイクロプレートリーダー、振とう装置をオートメーションワークステーションに統合することで実現されます。このプロトコルは、酵母 S.cerevisiae に統合されたさまざまな光遺伝学的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R35GM128873と米国国立科学財団の助成金2045493(M.N.M.に授与)の支援を受けました。Megan Nicole McClean博士は、バロウズ・ウェルカム基金のサイエンティフィック・インターフェースでキャリア賞を受賞しています。Z.P.H.は、ゲノム科学トレーニングプログラム5T32HG002760へのNHGRIトレーニング助成金の支援を受けました。McClean研究室のメンバーとの実りある議論を認めており、特に、原稿にコメントを寄せてくださったKieran Sweeney氏に感謝します。
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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